7. İŞLETME PROJESİ
7.1 Açık ve Kapalı Yeraltı İşletmeciliği
ANA LIZ GARCIA ALVES1*; ANA LÚCIA MILUZZI YAMADA2a; PABLO COSTA MAGALHÃES3;
REGINALDO KELLER FERNANDES4; LUIZ HENRIQUE LIMA DE MATTOS2b; MARCOS JUN
WATANABE1a, CELSO ANTONIO RODRIGUES1b, CARLOS ALBERTO HUSSNI1c
1. Docentes, Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, s/n, Botucatu, SP, Brasil.
a: [email protected], b: [email protected], c: [email protected],
*autor para correspondência: [email protected]
2. Alunos de Doutorado, Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, s/n, Botucatu, SP, Brasil.
a: [email protected], b: [email protected].
3. Aluno de mestrado, Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, s/n, Botucatu, SP, Brasil.
4. Aluno de mestrado – Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto Biológico, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, s/n, Botucatu, SP, Brasil.
RESUMO
Objetivo: Verificar a resposta clínica dos animais e a inflamação articular durante a
reparação de lesões condrais, experimentalmente induzidas em equinos, tratadas com CTMs em gel de PRP associadas ou não às microfraturas.
Design: Doze equinos foram submetidos à artroscopia no tempo zero do experimento
(T0), onde foi induzida uma lesão condral de 15 mm de diâmetro na tróclea medial femoral de ambos os membros pélvicos. As 24 articulações femoropatelares foram divididas em quatro grupos e o defeito condral foi submetido ao tratamento conforme o grupo: GA: tratamento apenas com microfraturas. GB: tratamento com microfraturas associadas ao implante de células tronco mesenquimais (CTM) em gel de plasma rico em plaquetas (PRP). GC: recebeu o tratamento apenas com o implante de CTM em gel de PRP, e o GD foi o grupo controle. As CTMs foram extraídas do tecido adiposo e o PRP em gel foi obtido por protocolo de dupla centrifugação seguido da adição de trombina liofilizada bovina. As articulações foram acompanhadas até os cinco meses (T150) através de exames clínicos e laboratoriais.
Resultados: O emprego de CTM em gel de PRP no tratamento de lesões condrais
acresceu as concentrações de IL-1 e PGE2 no líquido sinovial, porém não influenciou nos escores de claudicação dos animais.
Conclusão: Devido às suas características biológicas, a associação de CTMs em gel de
PRP foi capaz de alterar as concentrações de IL-1 e PGE2 sinoviais transitoriamente. Provavelmente esse tipo de tratamento modifica o ciclo inflamatório articular em animais com lesões condrais induzidas.
Palavras-chave: articulação; cavalo; cartilagem; células-tronco; liquido sinovial. “Running headline”: Stem cell and PRP gel in chondral defects
INTRODUÇÃO
A grande incidência da osteoartrite em equinos, assim como a utilização desses animais como modelos experimentais resulta em um aumento substancial de diversas pesquisas e estudos pré-clínicos envolvendo a terapêutica de lesões condrais e doenças articulares. A sinovite, a capsulite, e a importância da inflamação da membrana sinovial na fisiopatologia da osteoartrite é bem conhecida. Sabe-se que tal alteração contribui de forma significativa para a degradação da cartilagem articular, através da manutenção do processo inflamatório articular, consequente da liberação de enzimas catabólicas, mediadores inflamatórios e citocinas no líquido sinovial [1]. Por isso, as diferentes formas de terapia celular e a medicina regenerativa são constantemente testadas no tratamento dessa doença, com relatos bem sucedidos desde o implante autólogo de condrócitos [2, 3, 4]. As células-tronco mesenquimais (CTM) e o plasma rico em plaquetas (PRP) têm sido amplamente utilizados no tratamento das alterações articulares com resultados satisfatórios.
Atualmente, a literatura já traz uma série de competências positivas inerentes às CTMs e ao PRP. Sabe-se que as CTMs além de apresentarem capacidade de expansão e de diferenciação, possuem efeito quimiotáxico e possivelmente são capazes de realizar imunomodulação local, agindo significativamente sobre a membrana sinovial [5, 6]. Igualmente, o PRP é um produto autólogo, que proporciona uma alta concentração de fatores de crescimento no local da lesão, aumentando a capacidade e a velocidade de reparação do tecido [7, 8, 9, 10, 11]. Depois de tantos progressos, o emprego da terapia celular possibilitou que os pesquisadores aproximassem-se de uma reparação da cartilagem muito próxima ao ideal. A influência mútua das células-tronco com um arcabouço tridimensional biocompatível, o gel de PRP, e ao mesmo tempo, a interação dessa associação terapêutica com a homeostase articular, com a resposta celular e molecular tem sido estudada [4, 9, 12].
As pesquisas em relação à resposta imune originada após a aplicação de CTMs são cada vez mais controversas. Parte da literatura afirma que as CTMs são capazes de modular a função do sistema imune adaptativo, como os linfócitos T e B, além de estimular a expressão de IL-10, TGF-β e ILra, reduzindo a inflamação [13]. Acredita-se que algumas citocinas próinflamatórias, como o INF-Ɣ, o TNF-α e IL-6 são capazes de alterar o potencial imunomodulador das CTMs [14]. Essas células, porém, podem igualmente estimular a liberação de mediadores próinflamatórios e participar da
apresentação de antígenos, comportando-se como imunogênicas, dependendo das condições inflamatórias ou estímulos locais [13, 15].
As CTMs constituem uma população heterogênea de células, que podem ser provenientes de diferentes tecidos, sendo submetidas a variados procedimentos laboratoriais e de cultivo. Acredita-se que essas células heterogêneas sejam capazes de alterar significativamente seu fenótipo, seu potencial de diferenciação e expressão gênica dependendo da manipulação a qual são submetidas e do microambiente o qual elas serão aplicadas [13]. De maneira geral, as células-tronco mesenquimais possuem propriedades imunomoduladoras, sendo capazes de expressar moléculas anti- inflamatórias como a IL-10, o antagonista de interleucina 1 (IL-1ra), indolamina 2,3- dioxigenase (IDO), TGF-β e PGE2, desde que recebam um estímulo adequado para isso [8, 10, 13].
Em relação ao arcabouço de PRP, a ampla variedade de fatores de crescimento, proteínas indutoras e bioativas presentes nos α-grânulos plaquetários além de estimular a síntese da matriz extracelular condral, são igualmente capazes de neutralizar o efeito catabólico de diversas citocinas próinflamatórias presentes em uma articulação com osteoartrite, como a interleucina-1 (IL-1β), a interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). A produção dessas citocinas catabólicas (IL-1β, IL-6 e TNF-α) estão sob controle do fator de transcrição nuclear кB (NF- кB). O PRP, quando aplicado dentro de uma articulação é capaz de bloquear os efeitos decorrentes da ativação da molécula NF - кB, protegendo a cartilagem articular [11, 16]. BROWNING et al. (2012) [17] relataram que sinoviócitos cultivados junto ao PRP demostraram maior produção de interleucinas e metaloproteinases, o que poderia levar ao maior catabolismo articular. Porém, os fatores de crescimento presentes no PRP favorecem processos anabólicos celulares, exigindo assim, a investigação detalhada destas interações em estudos pré- clínicos.
Provavelmente, as CTMs realmente possuem capacidades de imunomodulação induzidas, porém, essa característica depende dos estímulos locais, como a presença de citocinas próinflamatórias e a manutenção em estruturas supramoleculares. As características inflamatórias do microambiente no qual as CTMs e o PRP serão aplicados influenciam de modo direto a ação e comportamento das células e a ação desse concentrado de plaquetas. A influência mútua das células com as citocinas presentes na articulação e principalmente com as existentes no arcabouço de PRP, na qual estão protegidas, parecem definir se as CTMs exercerão uma ação
imunomoduladora ou imunogênica [9, 10, 12]. Considerando os resultados benéficos da aplicação de CTM em gel de PRP apresentados em diversos estudos atuais, é necessária uma melhor investigação nessa área, podendo definir e controlar os eventos que regem a ação imunomoduladora e anti-inflamatória das CTMs e do PRP, tornando esse tipo de tratamento mais completo.
Sendo assim, esse estudo teve como objetivo investigar a ação dos tratamentos com CTMs em gel de PRP e microfraturas, de forma isolada e em tratamento combinados, na modulação da inflamação sinovial, através de exames clínicos e imunoensaios de amostras do líquido sinovial.
MATERIAL E MÉTODOS Animais
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais sob protocolo número: 225/2011 – CEUA. Foram utilizadas 24 articulações femoropatelares de 12 animais, que foram divididas em quatro grupos (A, B, C e D), cada grupo foi formado por seis articulações, de seis animais. Em todos os grupos, as articulações femoropatelares de ambos os membros pélvicos foram abordadas por cirurgia artroscópica para a realização de um defeito condral e submetidas a tratamento conforme o grupo: Grupo A (Membro Pélvico Esquerdo, MPE dos animais 1, 2, 3, 4, 5 e 6) receberam o tratamento apenas com microfraturas. Grupo B (MPE dos animais 7, 8, 9, 10, 11 e 12) receberam o tratamento com microfraturas associadas ao implante de células tronco mesenquimais (CTM) em gel de plasma rico em plaquetas (PRP). Grupo C (Membro Pélvico Direito, MPD dos animais 7, 8, 9, 10, 11 e 12) receberam o tratamento apenas com o implante de CTM em gel de PRP, e o Grupo D: (MPD dos animais 1, 2, 3, 4, 5 e 6) foram o grupo controle do experimento, sem a aplicação de tratamentos.
Indução do defeito condral
O primeiro procedimento artroscópico foi considerado como tempo zero (T0) do experimento, sendo abordados todos os grupos experimentais. A lesão cartilaginosa da tróclea medial do fêmur foi realizada de acordo com técnica descrita por MCLWRAITH
(2005) [18]. As lesões foram padronizadas em aproximadamente 15 mm de diâmetro, mensuradas com o auxílio do instrumental artroscópico e induzidas retirando a cartilagem hialina e toda a cartilagem calcificada, porém, não havendo abrasão, perfuração ou sangramento do osso subcondral. Ao final da indução do defeito condral em todos os grupos, foram realizados os tratamentos, no mesmo tempo cirúrgico, de acordo com cada grupo experimental.
Células-tronco
As CTMs foram obtidas e cultivadas a partir do tecido adiposo dos equinos que constituíram os grupos B e C, coletado 40 dias antes de T-0. A extração da fração vascular estromal e o cultivo celular foram realizados segundo técnica descrita para equinos YAMADA et al (2012) [3]. A contagem das células foi realizada em Câmara de Neubauer e a viabilidade média das células no momento da aplicação foi mensurada através da técnica de Azul de Trypan, sendo o resultado da média aritmética da viabilidade de cada garrafa de um mesmo animal, calculado por fórmula matemática. A caracterização das CTMs foi realizada após a terceira, quarta ou quinta passagem, anteriormente à aplicação dos tratamentos, pela reação antígeno-anticorpo, por citometria de fluxo e marcadores de superfície. Para estas análises foi utilizado o equipamento BD LSR Fortessa (Becton Dickinson. Mountain View, CA, USA) equipado com lasers: azul 488-nm, 100 mW; vermelho 640-nm, 40 mW e violeta 405- nm, 100 mW. As análises de citometria de fluxo foram arquivadas e avaliadas através do software FACSDiva™ software V6,2. Os marcadores positivos utilizados foram: CD90, CD105 e CD44. O marcador negativo utilizado foi o MHC CLASS II. Ainda objetivando a caracterização, parte das CTMs obtidas para o tratamento foi submetida às diferenciações, com o uso de “kits” comerciais, em tecido cartilaginoso, ósseo e adiposo (GIBCO – Invitrogen Cell Cuture) seguindo as instruções do fabricante. Os cultivos resultantes das diferenciações foram corados com Azul de toluidina e Alcian Blue para cartilagem; Alizarin Red para o tecido ósseo; e Oil Red para o tecido adiposo.
Plasma rico em plaquetas
Igualmente para os animais constituintes dos Grupos B e C, o PRP foi processado pelo método de centrifugação dupla, com sangue total coletado em tubo de citrato de
sódio a 3,8%, utilizando o seguinte protocolo: primeira centrifugação a 300g por 5 minutos, segunda centrifugação a 700g por 15 minutos, sendo descartados 75% do plasma sobrenadante apenas após a segunda centrifugação. Foi desprezada a zona de névoa (“Buffy Coat”) e toda a manipulação do plasma foi realizada sob temperatura controlada. O PRP tinha que apresentar uma contagem igual ou maior que 500.000 plaquetas/µL para a viabilidade de utilização, que foi verificado por contagem microscópica em câmara de Neubauer espelhada. Parte do PRP obtido foi destinada para a quantificação do fator de crescimento IGF-1, sem congelamento. A quantificação de IGF-1 foi realizada através de teste imunoenzimático utilizando um “kit” ELISA1 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) comercial, de acordo com as instruções observadas na bula do produto.
Microfraturas
As microfraturas foram realizadas em T0, imediatamente após a indução da lesão condral, nos grupos A e B. Com o auxílio de um perfurador artroscópico foram criadas seis perfurações dentro do defeito condral, com uma profundidade aproximada de 6 mm, mensuradas com o próprio perfurador.
Tratamento intralesional da associação de CTM em gel de PRP
O implante intralesional das CTM associadas ao gel de PRP para as articulações dos Grupos B e C foi realizado no mesmo momento artroscópico de T0; imediatamente após a indução da lesão para o Grupo C e após a realização das microfraturas para o Grupo B. Para cada articulação tratada do Grupo B e C, o “pellet” de células tronco mesenquimais autólogas previamente cultivadas (107 células para cada lesão tratada) foi ressuspenso em 4 mL de PRP autólogo previamente processado. No momento da aplicação do implante ao leito receptor foi adicionado para cada 1 mL do composto CTM e PRP (4 mL) 10% de cloreto de cálcio (Sigma-Aldrich) a 10% (para ativação do PRP) e 15% de trombina bovina (Sigma-Aldrich - lyophilized powder, 600-2,000 NIH units/mg protein) reconstituída em água estéril para formação do coágulo de fibrina (arcabouço gel de PRP). Em fase final de gelificação o composto foi colocado sobre a lesão induzida, com o auxílio de uma agulha 30 x 80, e a distensão articular com CO2 foi mantida até a completa secagem e fixação do gel.
Avaliação clínica – exames de claudicação.
Para o acompanhamento dos grupos, todas as articulações foram avaliadas clinicamente, imediatamente antes da realização do defeito de cartilagem e implante dos tratamentos por artroscopia (T0) e em T15, em T60 e T150 (final do experimento), quanto à claudicação, graduada em escores de 0 a 5 segundo STASHAK (2006) [20]. Os exames foram filmados e, ao mesmo tempo, realizados por três avaliadores, que não sabiam a qual grupo pertencia o animal. Os animais foram inspecionados diariamente para possíveis reações inflamatórias locais.
Análise do líquido sinovial – quantificação de IL-1 e PGE2 sinoviais.
A determinação da concentração da prostaglandina E2 (PGE2) e de Interleucina -1 (IL-1) sinovial foi realizada para as articulações em T0, T15, T60 e T150 através de teste imunoenzimático utilizando “kits” ELISA comerciais, de acordo com as instruções observadas na bula dos produtos 2;3. A sensibilidade do “kit” era de 0,140 pg/mL (alcance de 0,125-8 pg/mL) e volume da amostra de 150 microlitros. O líquido sinovial foi coletado nos diferentes momentos do experimento e foi congelado, após centrifugação, em tubos Eppendorfs® a -80º C até o momento da quantificação.
Análise estatística
Foi utilizada a metodologia de ANOVA, com medidas repetidas (no tempo) para avaliar o efeito do grupo nas variáveis do liquido sinovial (IL-1, PGE2) e Claudicação. Todos os testes de hipóteses desenvolvidos nesse trabalho consideraram uma significância de 5%, ou seja, a hipótese nula foi rejeitada quando p-valor foi menor ou igual a 0,05. O software utilizado nas análises foi o The SAS System 9.0.
RESULTADOS
Foram aplicadas em média 1,35 x 107 células por articulação tratada, com viabilidade média das células no momento da aplicação de 95,61%. As análises de citometria de fluxo apresentaram média de marcação de 81,47% para o CD44, 95,72% para o CD 90, 63,15% para o CD105 e de 2,63% para o MHC Classe II. Todas as
células submetidas às diferenciações através dos “kits” comerciais confirmaram a transformação em tecido ósseo, adiposo e cartilaginoso. A média da contagem plaquetária aplicada foi de 720.478 plaquetas/mL nos animais que utilizaram o tratamento em gel, grupos B e C. A média dos resultados da quantificação de IGF-1 foi de 166,50 ng/mL. A suspensão de 4 mL de PRP e CTMs adicionado de 10% de cloreto de cálcio a 10% e 15% de trombina bovina demonstrou uma excelente consistência e fixação no leito receptor, no momento da aplicação nos grupos B e C (Figura 01).
Avaliação clínica – Exames de claudicação.
Na avaliação clínica, não foram observadas reações clínicas indesejáveis nas articulações, decorrentes do implante dos tratamentos. Nenhuma das articulações apresentou efusão sinovial exacerbada, dor à palpação, elevação de temperatura local ou deiscência de pontos. Para os escores de claudicação, por se tratar de uma variável ordinal, a metodologia mais indicada para avaliar o efeito do grupo considerando as medidas repetidas no tempo seria o teste não paramétrico de Friedman. Porém, devido ao baixo número de unidades amostrais por grupo, o desenvolvimento desse teste se tornou inviável. Dessa forma, a variável dependente foi transformada de modo que os resíduos se aproximassem da normalidade. A transformação aplicada foi 1/Claudicação. Sendo assim, foi detectado efeito estatisticamente significativo da interação entre o grupo e o tempo na variável dependente analisada, p-valor menor que 0,0001. Através das comparações múltiplas de Tukey observou-se que o grupo D foi estatisticamente diferente dos grupos B (p-valor=0,0095) e C (p-valor=0,0378) no tempo 60 (Figura 02).
Análise do líquido sinovial – quantificação de IL-1 e PGE2 sinoviais.
Foi detectado efeito estatisticamente significativo da interação entre o grupo e o tempo para IL-1 (p-valor=0,045) e para PGE2 (p-valor=0,0166). Através das comparações múltiplas de Tukey, foi possível identificar que, em relação à IL-1, o grupo A mostrou-se estatisticamente diferente do grupo B nos tempos 15 (p- valor=0,0047) e 150 (p-valor=0,0189). Observou-se ainda que o grupo B foi estatisticamente diferente do grupo D no tempo 15 (p-valor=0,0113) (Tabela 01, Figura 03). Em relação à PGE2, se observou nas comparações múltiplas de Tukey que o grupo
A foi estatisticamente diferente do grupo B no tempo 15 (p-valor=0,0397) e que o grupo B foi estatisticamente diferente do grupo C no tempo 150 (p-valor=0,0377) (Tabela 02, Figura 04).
DISCUSSÃO
A utilização do gel de PRP, como um arcabouço, no suporte para a aplicação das CTMs, se mostrou efetivo, e seguramente auxiliou a fixação das CTMs no leito receptor. A alta concentração de fatores de crescimento é indispensável no tratamento de lesões condrais. Analisado nesse estudo, o IGF-1 tem como principais funções estimular a mitose das CTMs e condrócitos, além de aumentar a produção de proteoglicanos, inibir a apoptose e a inflamação mediada pela IL-1 [4, 11]. XIE et al. (2012) [7] relataram que o PRP cria um microambiente favorável no inicio do processo de reparação tecidual, principalmente liberando citocinas. O gel formado pelo coágulo de fibrina estimula a diferenciação das CTMs em condrócitos e a consequente produção de matriz extracelular [3]. O gel foi facilmente aplicado no local da lesão, em fase final de gelificação, sem que houvesse comprometimento das células ou do formato em três dimensões do arcabouço.
No caso de lesões condrais, um tecido de reparação de qualidade é indispensável para o controle da osteoartrite. O tecido neoformado deve apresentar as mesmas características morfofuncionais da cartilagem hialina normal. Uma reparação constituída por fibrocartilagem mantém o desequilíbrio de forças, a agressão ao osso subcondral, a degeneração condral e consequentemente o ciclo inflamatório articular [1]. Essa série de eventos acresce o grau de claudicação e a concentração de citocinas próinflamatórias no líquido sinovial [1]. Porém, nesse experimento, não foram observadas diferenças significativas nos graus de claudicação entre os grupos tratados e controle, foram observadas apenas diferenças significativas nas concentrações de IL-1 e PGE2.
Os maiores escores de claudicação observados em T15 provavelmente foram decorrentes da manipulação cirúrgica e criação da lesão condral. Houve uma pequena diferença dos escores no grupo D, que se apresentou discretamente maior, porém sem diferença estatística. A pequena melhora nos escores de claudicação dos grupos tratados se deveu possivelmente à ação das CTMs, que inativaram linfócitos T e produziram citocinas anti-inflamatórias, sendo uma pequena parcela resultante da ação do PRP [21,
22]. O PRP tem se demonstrado eficaz no controle da dor em pacientes portadores de osteoartrite, assim como tem sido descrito uma excelente atuação na recuperação rápida e plena da movimentação articular. As plaquetas transportam diversos moduladores inflamatórios, como interleucinas anti-inflamatórias (IL-10) e quimiotáxicas (IL-8), podendo alterar o ciclo inflamatório articular no caso da osteoartrite e consequentemente reduzir a dor [7, 9, 23].
O PRP é responsável por transportar, além dos fatores de crescimentos, diversas citocinas próinflamatórias e anti-inflamatórias [9]. Alguns autores [9, 23] observaram a presença de interleucinas (IL-1, IL-10, IL-6, IL-4), TNF-α e INF-Ɣ no PRP ativado. Embora haja a presença de citocinas próinflamatórias no PRP, a quantidade de interleucinas anti-inflamatórias é cinco vezes superior às concentrações de IL-1, ou seja, as concentrações de IL-1 são ínfimas [11]. Deduzimos que a quantidade de interleucinas presentes no volume utilizado no arcabouço de PRP não foi suficiente para alterar a proporção dessas moléculas no líquido sinovial dos equinos tratados, porém, o PRP ativado, mesmo em pequenas quantidades, pode gerar uma resposta inflamatória inicial transitória, seguida da resolução da inflamação [11], fato que pode justificar o aumento de IL-1 nos momentos após os tratamentos com CTMs em gel de PRP.
O PRP é capaz de agir de forma positiva no controle da inflamação na osteoartrite. Esse composto autólogo inibe a liberação de metaloproteinases, desintegrinas e de NF-kB, responsável por iniciar parte da patogênese da osteoartrite [11]. Embora o PRP possua uma capacidade anti-inflamatória considerável, suficiente para reduzir os graus de claudicação [3], nesse experimento, inferimos que o volume de