Durante o processo de embriogênese somática são definidas as fases de indução, proliferação, maturação e germinação dos embriões somáticos (Warren, 1993). A maturação é uma fase crítica e limitante, para várias espécies arbóreas, o que resulta em uma baixa taxa de conversão de embriões em plantas (Capuana & Debergh, 1997; Stasolla & Yeung, 2003).
A remoção de auxinas e citocininas, usadas em meios de manutenção e multiplicação, e a adição de ABA e agentes osmóticos (PEG e maltose), promovem um aumento da osmolaridade do meio de cultura, resultando na produção de embriões em estádios avançados de desenvolvimento, para várias espécies de coníferas (Gupta & Pullman, 1991; Shoji et al., 2006). Essa estratégia tem se mostrado bastante eficiente, nos diferentes sistemas vegetais, para a maturação dos pró-embriões somáticos presentes nas culturas celulares.
Dependendo do sistema vegetal estudado, observam-se diferentes necessidades de combinações dos vários agentes de maturação. Em P. taeda, o meio de maturação, contendo PEG (6%), maltose (4%) e ABA (150 µM), foi o mais eficiente para induzir a formação de embriões somáticos cotiledonares (Li et al., 1998). Por outro lado, para de P. brutia a melhor combinação para a maturação observada foi de 80 µM de ABA, com 6% de maltose e 3,75% de PEG, em culturas de embriões somáticos mantidos em meio semi-sólido (Yildirim et al., 2006). Para A.
angustifolia,em estudos preliminares, foi demonstrado que o tratamento de
maturação, promovido pela adição de PEG (7%) e de maltose (9%) ao meio de cultura, com ou sem adição de ABA (60 µM), promoveu a maturação de embriões somáticos (dos Santos et al., 2002).
No presente trabalho a combinação de ABA (120µM), PEG (7%) e maltose (9%), mostrou ser o tratamento mais eficiente para a maturação dos embriões somáticos da linhagem MSG, de A. angustifolia. Observou-se que os pró-embriões atingiram estádios avançados do desenvolvimento embrionário, evidenciado pela formação das estruturas bipolares (Fig. 18). Contudo, não se observou a presença de embrião maduro, ou seja, embrião no estádio cotiledonar. Provavelmente esse fato esteja relacionado com a utilização de um meio de cultura líquido para a maturação. Diversos estudos ressaltam que, a grande maioria das espécies de coníferas, apresentam a maturação de pró-embriões e a evolução dos embriões somáticos para
maduros, em meio semi-sólido. Alguns autores sugerem que em meio semi-sólido, as altas concentrações de agentes geleificantes estimulam a formação de embriões somáticos, como observado para P. strobus (Klimaszewska & Smith, 1997; Klimaszewska et al., 2000). Essa situação foi considerada como semelhante ao efeito osmótico não plasmolizante do PEG (Yildirim et al., 2006) pela redução da disponibilidade de água. No presente trabalho, embora não tenha sido utilizado o meio semi-sólido para a maturação, mas sim o meio de cultura líquido por propiciar uma melhor metodologia para os estudos de visualização e quantificação de NO, pode-se visualizar que as culturas quando incubadas com os promotores de maturação apresentaram vários aspectos similares aos observados para as culturas embriogênicas mantidas no meio de maturação semi-sólido.
Verificou-se no presente trabalho que a adição de agentes promotores da maturação (ABA, PEG e maltose) promoveu uma redução no crescimento celular, em matéria seca, nas duas linhagens utilizadas de A. angustifolia (Fig. 8). Adicionalmente, verificou-se uma redução no crescimento com o aumento na concentração dos promotores de maturação ABA, PEG e maltose incorporados ao meio de cultura (Fig.4). Conforme verificado em diferentes materiais, a redução no crescimento e no conteúdo de água das culturas embriogênicas é uma característica desejável para a obtenção de maturação dos embriões somáticos (Attree & Fowke, 1993; von Arnold et al., 2002). Durante a etapa de maturação observa-se uma redução na atividade de divisão celular, e uma consequente evolução na diferenciação do embrião, onde diferentes tipos de agentes promotores de maturação atuam de forma individualizada (Attree & Fowke, 1993).
Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que, os agentes osmóticos, PEG e maltose, diminuem a produção intracelular de ROS e NO, nas culturas embriogênicas da linhagem MSG, ao mesmo tempo em que promovem a sua maturação (Fig. 5-7 e 21-24). Essas observações levam a hipótese de que uma redução na produção dessas substâncias (NO e ROS), associado à redução do crescimento celular, seja fundamental para ocorrer o processo de maturação das culturas embriogênicas em A. angustifolia. Essa hipótese está de acordo com resultados observados por Silveira et al. (2006), que verificaram a redução nos níveis de NO na presença das PAs Spd e Spm, as quais promoveram uma evolução das culturas embriogênicas de A. angustifolia. Adicionalmente, Osti et al. (2010) também mostraram que a adição de NO resulta num aumento do conteúdo endógeno de NO, o qual está associado ao crescimento celular sem evolução morfogenética das culturas embriogênicas de A. angustifolia em suspensão celular.
Verificou-se ainda neste trabalho, que a adição dos agentes promotores de maturação resultou na evolução morfogenética das culturas embriogênicas somente na linhagem MSG, a qual apresentou o desenvolvimento de embriões em estágios avançados de maturação (Fig. 18). Entretanto, esta resposta na evolução morfogenética não foi observada para a linhagem BM (Fig. 17), embora tenha sido verificada resposta similar com relação ao crescimento celular e conteúdo endógeno de NO e ROS entre as duas linhagens utilizadas. Estes resultados sugerem que, embora os agentes promotores de maturação sinalizem resposta similar em relação ao conteúdo de NO e ROS para as duas linhagens quando submetidas a maturação, somente a que possui competência para a evolução é que efetivamente resultará na evolução morfológica adequada. Estudos com diferentes sistemas experimentais demonstram um aumento na qualidade e quantidade de embriões somáticos quando o meio de cultura utilizado na maturação contém promotores de maturação, como ABA, PEG e maltose (Attree & Fowke, 1993; Capuana & Debergh, 1997; Klimaszewska & Smith, 1997; Guerra et al., 2000, Filonova et al., 2000). É importante salientar aqui também, um possível efeito dos componentes dos meios de cultura utilizados neste trabalho, comparando-se os meios BM e MSG possibilitando assim, esta diferença na evolução morfológica das culturas embriogênicas em A.
angustifolia.
Os resultados iniciais obtidos neste trabalho são inéditos e fundamentais para o entendimento do processo de sinalização celular durante a maturação das culturas embriogênicas nesta espécie.