Kritik Başarı Faktörlerinin Belirlenmesi (FTÜZ Analizi)

CAPÍTULO 3 - A DISFUNÇÃO NEUTROFÍLICA VARIA COM O ESTÁGIO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

ALMEIDA, B.F.M.; NARCISO, L.G.; BOSCO, A.M.; PREVE, P.P.; BRAGA, E.T.; AVANÇO, S.V.; MARCONDES, M.; CIARLINI, P.C.

Resumo - A leishmaniose visceral canina (LVC) causa alteração do

metabolismo oxidativo neutrofílico de forma dependente do estágio da doença, aumentando a produção de superóxido nos estágios iniciais da doença, com decréscimo nos estágios finais, quando o quadro de uremia está instalado. Quando a produção de espécies reativas de oxigênio, como o superóxido, excede a capacidade antioxidante da célula, a apoptose é desencadeada, comprometendo a função celular, o que poderia predispor os animais à infecções. Para melhor entender esta relação, no presente estudo foi comparada a taxa de apoptose e o metabolismo oxidativo dos neutrófilos de cães com LVC nos estágios moderado e muito severo. Foram utilizados no estudo 20 cães controle, 15 cães no estágio moderado e 15 no estágio muito severo da doença classificados de acordo com o LeishVet Consensus. A produção de superóxido foi quantificada utilizando o teste de redução do tetrazólio de nitroazul (NBT) em neutrófilos isolados do sangue total. A taxa de apoptose dos neutrófilos foi estimada pelo método morfológico em neutrófilos isolados. Ocorreu aumento da produção de superóxido dos neutrófilos de cães no estágio moderado da doença. Enquanto que nos neutrófilos de cães no estágio muito severo houve diminuição da produção de superóxido e aumento da taxa de apoptose. Conclui-se que a leishmaniose causa disfunção neutrofílica dependente do estágio da doença, de forma que nos estágios finais parece haver comprometimento da imunidade inata.

Palavras-chave: polimorfonucleares, Leishmania spp., superóxido, morte

1 Introdução

Os neutrófilos são as principais células efetoras na imunidade inata dos mamíferos, realizando a defesa inicial contra micro-organismos invasores. Uma vez recrutados e ativados por mediadores químicos, exercem sua função microbicida destruindo os agentes invasores após fagocitose e liberação de enzimas líticas e espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas a partir do ânion superóxido (BORREGAARD et al., 2007). Além disso, os neutrófilos atuam como uma conexão entre as respostas imunes inata e adquirida, além de participarem na resolução da inflamação (NATHAN, 2006).

Na presença de estímulo, os neutrófilos respondem rapidamente com a produção de ERO, principalmente quando pré-ativados (HOSTETTER, 2012). Entretanto, quando a produção de ERO excede a capacidade antioxidante da célula, estruturas celulares são oxidadas e o processo de apoptose é desencadeado devido ao estresse oxidativo. Uma vez iniciada a apoptose, a célula se torna menos funcional, reduzindo sua capacidade fagocítica e seu metabolismo oxidativo (ANWAR; WHYTE, 2007).

A capacidade de alguns micro-organismos em modificar o metabolismo oxidativo e o processo de apoptose dos neutrófilos é amplamente conhecida como componente chave na evasão do sistema imune (ANWAR; WHYTE, 2007). Dentre esses micro-organismos, parasitas do gênero Leishmania vêm sendo amplamente estudados em modelos humanos in vitro devido à sua habilidade em inibir o metabolismo oxidativo (LAUFS et al., 2002) e a apoptose de neutrófilos parasitados (AGA et al., 2002). Por serem os primeiros a chegar ao sítio de infecção, os neutrófilos funcionariam como “cavalos de Tróia” no estabelecimento da infecção. Estes albergariam o protozoário até a chegada dos monócitos, para assim entrar em suas células-alvo sem ativação do metabolismo oxidativo (LASKAY et al., 2003; SUNDERKOTTER et al., 1993).

Embora seja conhecido o papel dos neutrófilos no estabelecimento da infecção, os estudos sobre a função neutrofílica na leishmaniose visceral canina (LVC) são escassos e contraditórios. In vitro, a Leishmania spp. é capaz de sobreviver em compartimentos não líticos dos neutrófilos caninos e atrasar a

apoptose da célula (GUEIRARD et al., 2008). In vivo, Brandonisio et al. (1996) e Vuotto et al. (2000) observaram uma diminuição do metabolismo oxidativo devido à menor capacidade dos neutrófilos de cães com leishmaniose em responder a estímulos quando comparados a um grupo controle.

Diferentemente, Gómez-Ochoa et al. (2010) e Ciarlini et al. (2010) utilizando o teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT), observaram aumento do metabolismo oxidativo neutrofílico na leishmaniose visceral canina. Acredita-se que o aumento do metabolismo oxidativo nesses animais estaria relacionado com o perfil de mediadores inflamatórios produzidos em cães assintomáticos e resistentes à infecção (PINELLI et al., 1994).

Malafaia e Rezende (2009) ao revisarem o tema ressaltaram a importância de se avaliar a função neutrofílica em diferentes estágios da doença. Neste sentido, Gómez-Ochoa et al. (2010) sugeriram que a alteração no metabolismo oxidativo é dependente do estágio da LVC, ocorrendo aumento da produção de superóxido nos estágios iniciais e uma discreta redução em estágios avançados da doença, o que poderia predispor os animais a outros processos infecciosos.

Quando comparada à fase inicial, cães em fases mais avançadas da leishmaniose visceral são frequentemente acometidos por co-infecções (ANDREOTTI et al., 2006; FEITOSA et al., 2000) e geralmente desenvolvem quadro de uremia devido a doença renal crônica (DRC) (COSTA et al., 2003; ZATELLI et al., 2003). Recentemente, demonstrou-se que as toxinas urêmicas comprometem a função dos neutrófilos em cães (BARBOSA et al., 2010) e outras espécies (CENDOROGLO et al., 1999; KEEGAN; WEBB, 2010). Para melhor entender esta relação, no presente estudo foi comparada a taxa de apoptose e o metabolismo oxidativo dos neutrófilos de cães com leishmaniose nos estágios moderado e muito severo. Foi possível estabelecer que há alteração do metabolismo oxidativo e apoptose dos neutrófilos nas diferentes fases da LVC, o que justificaria variações da resposta imune nos diferentes estágios da infecção.

2 Material e Métodos

O experimento ocorreu de acordo com os princípios éticos em uso de animais do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Estadual Paulista (Protocolo FOA-9678/10).

Com base nos resultados dos exames clínicos, 50 cães adultos (2-8 anos) de diferentes raças foram selecionados e divididos em três grupos: Grupo controle (n=20), constituído de 10 machos e 10 fêmeas, todos saudáveis; Grupo Leish II (n=15), composto por oito machos e sete fêmeas, todos no estágio moderado da doença (com linfadenopatia, onicogrifose, lesões de pele e anemia sem alteração da função renal); Grupo Leish IV (n=15), constituído de nove machos e seis fêmeas no estágio muito severo da doença (com linfadenopatia, lesões de pele, ulcerações, evidências de sangramento, anemia não-regenerativa, hiperglobulinemia, hipoalbuminemia). Os animais do Grupo Leish IV também apresentam uremia devido a DRC classificada nos estágios III e IV de acordo com as diretrizes da International

Renal Interest Society (IRIS, 2006).

Os cães com leishmaniose foram estadiados de acordo com os critérios propostos pelo LeishVet Consensus (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Foram considerados com LVC apenas os animais com presença de formas amastigotas no exame parasitológico direto de material obtido por punção aspirativa de linfonodo poplíteo. Os cães saudáveis foram negativos no exame parasitológico direto e na sorologia com ELISA para leishmaniose (LIMA et al., 2003), além de não apresentarem qualquer alteração nos exames físico e laboratorial (hemograma, urinálise e perfil bioquímico plasmático). Animais tratados com medicamentos que alterassem a função neutrofílica não foram incluídos no estudo.

Após jejum alimentar de 8 a 12 horas, 10 mililitros de sangue total foram colhidos de cada animal por punção da jugular. Sendo nove mililitros de sangue acondicionados em tubos heparinizados estéreis para realização do isolamento dos neutrófilos e obtenção de plasma para análises bioquímicas. O restante do sangue foi acondicionado em tubo com EDTA para realização do hemograma.

As análises bioquímicas plasmáticas foram realizadas em espectrofotômetro automatizado (BTS 370 Plus, Biosystems, Barcelona, Espain) previamente calibrado com calibrador e soros controles níveis I e II e utilizando reagentes comerciais (Biosystems, Barcelona, Espain). Foi determinado o teor de ureia (método enzimático UV urease/glutamato desidrogenase); creatinina plasmática e urinária (método cinético do picrato alcalino); albumina (método do verde de bromocresol); colesterol (método enzimático oxidase/peroxidase); proteína plasmática total (método do biureto); e proteína urinária (método vermelho de pirogalol). Todas as reações bioquímicas foram processadas a 37°C conforme orientações dos fabricantes.

O hemograma foi realizado em contador automatizado de células veterinário (BC-2800Vet, Shenzhen Mindray Bio-Medical Eletronics Co., Nanshan, China). A urina foi colhida por cistocentese para realização do exame de urina tipo I e determinação da relação proteína/creatinina urinária (UPC). A densidade urinária foi obtida por refratometria, o exame químico foi realizado utilizando tiras reagentes comerciais (Combur10 test®, Roche, Mannheim, Germany) e a análise do sedimento foi feita segundo recomendações de Osborne et al. (1995).

Quatro mililitros de sangue heparinizado foram utilizados para o isolamento dos neutrófilos em duplo gradiente de separação contendo 3 mL de Histopaque-1119® e 3 mL de Histopaque-1070® (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA). As células isoladas foram então lavadas duas vezes com solução aquosa de cloreto de amônio (0,14 M) e uma vez com Solução Salina Balanceada de Hanks (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA). Após contagem em hemocitômetro, as células foram diluídas em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) na concentração 106_{/mL. A viabilidade foi estimada pelo}

método de exclusão do azul de tripan e a pureza foi determinada por citologia. Apenasos isolamentos que obtiveram viabilidade e pureza acima de 95 e 93%, respectivamente, foram incluídos no estudo.

A produção de superóxido neutrofílica foi estimada pelo método de redução do tetrazólio nitroazul (NBT). Para tal, 100 μL de suspensão de

neutrófilos (106/mL) foram incubados com 50 μL de solução salina de NBT 0,2% (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) na ausência e presença de 1 µL de acetato miristato de forbol (PMA) 16,2 μM (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) para realização da prova estimulada. Após incubação (37ºC) por dez minutos, seguidos de dez minutos em temperatura ambiente, as amostras foram citocentrifugadas e tingidas com corante panótico rápido. A porcentagem de células redutoras de NBT foi estabelecida a partir da contagem mínima de 100 neutrófilos. Foram considerados positivos neutrófilos que apresentavam precipitado azul-enegrecido no citoplasma típico do formazan.

Para a análise morfométrica da apoptose, 100 μL da suspensão de neutrófilos (106/mL) foram incubados com 100 μL de meio RPMI 1640 (prova espontânea) e com 100 μL do indutor camptotecina (CAM) 310,8 μM (Sigma- Aldrich Co., St. Louis, USA) para realização da prova induzida. Após quatro horas a 37ºC em agitador térmico computadorizado (Thermomixer, Eppendorf, Mod. Comfort, Hamburg, Germany), as amostras foram citocentrifugadas e tingidas com corante panótico rápido. Para a quantificação das células apoptóticas, foram consideradas somente as células que apresentaram pelo menos três das seguintes características morfológicas peculiares do processo: condensação do citoplasma, condensação nuclear, fragmentação nuclear, fragmentação celular e formação de corpos apoptóticos. O índice apoptótico foi estimado como a porcentagem de células apoptóticas a partir da contagem mínima de 100 neutrófilos.

Após análise das variáveis quanto à normalidade e homocedasticidade, foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn (Apoptose espontânea e induzida, NBT estimulado) e ANOVA com pós-teste de Tukey (NBT espontâneo) para verificar as diferenças entre os grupos. Os testes foram realizados em programa estatístico (SAS Institute Inc. The SAS System, release 9.2., Cary:NC, 2008), considerando estatisticamente significante quando p<0,05.

3 Resultados e Discussão

Os sinais clínicos e as análises laboratoriais dos cães do grupo controle e com leishmaniose visceral estão dispostos na Tabela 1.

As alterações clínico-laboratoriais estão de acordo com os resultados descritos por Baneth et al. (2008) na leishmaniose visceral canina. De forma geral, os animais com leishmaniose visceral apresentaram linfadenopatia, onicogrifose e caquexia, sendo que os animais no estágio final da doença apresentavam halitose urêmica, ulcerações na língua e mucosa oral, típicas da síndrome urêmica decorrentes da DRC. Os achados laboratoriais mais frequentemente observados foram anemia do tipo normocítica normocrômica, hiperproteinemia com hipoalbuminemia e hiperglobulinemia. Cães no estágio final da leishmaniose se diferenciaram dos demais por apresentarem diminuição da densidade urinária, anemia não-regenerativa e níveis de creatinina plasmática que caracterizam a uremia decorrente de DRC nos níveis III ou IV de acordo com o estadiamento da IRIS (IRIS, 2006).

A leishmaniose visceral alterou o metabolismo oxidativo e a taxa de apoptose dos neutrófilos de cães doentes de forma dependente do estágio da doença (Figuras 1 e 2). No estágio moderado da leishmaniose foi observado aumento significativo da produção de superóxido em relação ao grupo controle tanto na prova espontânea quanto estimulada com PMA (Figura 1). Enquanto no estágio muito severo da doença houve uma redução significativa da produção de superóxido na prova espontânea e aumento na prova estimulada com PMA (Figura 1). Neste estágio final, em relação aos demais grupos, houve ainda aumento significativo da taxa de apoptose nas provas espontânea e induzida com CAM (Figura 2).

Tabela 1 - Frequência de sinais clínicos e análises laboratoriais (média e

desvio padrão) de cães do grupo controle e com leishmaniose visceral nos estágios moderado (Leish II) e muito severo (Leish IV).

Parâmetro Controle Leish II Leish IV

Sinais clínicos

Linfadenopatia Ausente 80% 53,3%

Onicogrifose Ausente 73,3% 93,3%

Ulcerações de pele Ausente 33,3% 40%

Alopecia periocular Ausente 53,3% 20%

Caquexia Ausente 40% 93,3%

Halitose urêmica Ausente Ausente 93,3%

Ulceração oral e na língua Ausente Ausente 86,6%

Desidratação Ausente 20% 93,3% Exames laboratoriais Hemograma Volume globular (%) 47,7 ± 3,3 27,9 ± 7,5 21,5 ± 10,6 Hemácias (1012/L) 6,5 ± 0,5 3,87 ± 1,35 3,02 ± 1,54 Hemoglobina (g/dL) 15,9 ± 1,0 9,3 ± 3,2 6,9 ± 3,2 VCM (fL) 73,2 ± 2,9 72,3 ± 3,7 71,6 ± 3,6 CHCM (%) 33,3 ± 0,2 33,5 ± 0,7 32,1 ± 2,41 Leucócitos totais (109/L) 9,9 ± 2,6 13,0 ± 7,1 11,0 ± 6,23 Bioquímica Ureia (mg/dL) 32,6 ± 8,1 29,0 ± 10,8 263,0 ± 114,6 Creatinina (mg/dL) 1,07 ± 0,16 0,89 ± 0,25 4,43 ± 2,1 Proteína total (g/L) 65,8 ± 6,3 79,9 ± 19,0 80,9 ± 17,1 Albumina (g/L) 31,0 ± 1,9 20,8 ± 7,2 22,9 ± 4,1 Globulina (g/L) 34,8 ± 6,0 59,1 ± 18,9 58,0 ± 18,0 Colesterol (mg/dL) 178,3 ± 51,4 200,8 ± 46,6 256,7 ± 69,3 Urinálise Densidade urinária 1,043 ± 0,003 1,040 ± 0,009 1,016 ± 0,003 UPC 0,2 ± 0,07 0,8 ± 0,6 3,6 ± 1,5

* VCM – Volume corpuscular médio; CHCM – Concentração hemoglobínica corpuscular média; UPC – Relação proteína/creatinina urinária.

FIGURA 1 - Boxplot de neutrófilos produtores de superóxido (%) em cães do

grupo controle, leishmaniose moderada (Leish II) e leishmaniose muito severa (Leish IV) na presença e ausência do estímulo com acetato miristato de forbol (PMA). Letras não coincidentes indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).

FIGURA 2 - Boxplot da apoptose (%) de neutrófilos de cães do grupo controle,

leishmaniose moderada (Leish II) e leishmaniose muito severa (Leish IV) na presença e ausência da indução com camptotecina (CAM). Letras não coincidentes indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).

Controle Leish II Leish IV 0 20 40 60 80 100 Espontânea aa a b A popt os e ( % )

Controle Leish II Leish IV 0 20 40 60 80 100 Induzida (CAM) a a b A popt os e ( % )

Controle Leish II Leish IV

0 20 40 60 80 100 Estimulada (PMA) a b b N e ut róf il o s produt ore s de s upe róx ido ( % )

Controle Leish II Leish IV 0 20 40 60 80 100 Espontânea a b c N u e tróf il o s produt ore s de s upe róx ido ( % )

Os estudos avaliando o metabolismo oxidativo em neutrófilos de cães com leishmaniose apresentam resultados diferentes. No presente estudo, foi observado aumento da produção de superóxido tanto na prova espontânea quanto estimulada, corroborando com outros estudos que utilizaram o teste de redução do NBT (CIARLINI et al., 2010; GÓMEZ-OCHOA et al., 2010) e diferindo de outros autores que constataram inibição do metabolismo oxidativo utilizando quimiluminescência (BRANDONISIO et al., 1996; VUOTTO et al., 2000). Tais divergências entre resultados quanto à avaliação do metabolismo oxidativo neutrofílico já foi observada em humanos e deve-se, provavelmente, às diferentes metodologias utilizadas (CENDOROGLO et al., 1999). Além das diferentes metodologias, o fato de Vuotto et al. (2010) e Brandonisio et al. (1996) não terem considerado em seus estudos o estadiamento da doença também poderia justificar os diferentes resultados, uma vez que foi observado no presente estudo que no estágio final da doença ocorre uma inibição do metabolismo oxidativo, que pode ser devido à maior apoptose também observada nessa fase.

De forma similar ao presente estudo, Gómez-Ochoa et al. (2010) também observaram decréscimo do metabolismo oxidativo no estágio final da LVC, porém a diferença encontrada pelos autores foi discreta e não significativa. Segundo Gómez-Ochoa et al. (2010), o aumento do metabolismo oxidativo no estágio inicial da LVC pode estar relacionado à maior produção de agentes quimiotáticos como citocinas por cães assintomáticos, o que ativaria a produção de superóxido nesses animais e não em cães sintomáticos, garantindo resistência à infecção. Entretanto, no presente estudo, foi observado que mesmo os animais sintomáticos no estágio moderado da doença apresentaram aumento do metabolismo oxidativo, de forma que a maior produção de citocinas relacionada à resistência à infecção não poderia justificar o aumento da produção de superóxido.

Há necessidade de mais investigações para avaliar o significado da ativação dos neutrófilos no estágio moderado da LVC. O aumento do metabolismo oxidativo dos neutrófilos observado nesse estágio da infecção

poderia fortalecer a primeira linha de defesa do organismo. Entretanto, se esta ativação neutrofílica for prolongada, pode gerar estresse oxidativo e induzir a apoptose da célula, afetando a função dos neutrófilos e favorecendo co- infecções que podem agravar ainda mais o quadro clínico da LVC (KENNEDY; DELEO, 2009).

A ativação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos ocorre por vários e distintos mecanismos de transdução de sinal, sendo que alguns ativadores dependem do complemento (ionóforo de cálcio A23187), outros de opsonização (zymosan) e outros como o fMLP dependem de receptores protéicos específicos (EL-BENNA et al., 2008). Diferentemente de Brandonisio et al. (1996) que fizeram uso de zymosan, no presente estudo foi utilizado o PMA, um ativador neutrofílico mais potente que independe de receptores de membrana para ativar a NADPH oxidase e induz a produção de superóxido diretamente através da ativação de proteína C quinase (EL-BENNA et al., 2010). O fato de o PMA ter ativado o metabolismo oxidativo dos neutrófilos de cães no estágio final da doença sugere que a menor produção espontânea de superóxido nesse grupo deveu-se a uma falha na transdução de sinal ligado a proteína G responsável pela ativação da NADPH oxidase. Os resultados do presente estudo discordam dos relatos de Vuotto et al. (2010), que observaram inibição do metabolismo oxidativo neutrofílico mesmo na presença de estímulo com PMA.

Não foram encontrados estudos que tenham avaliado a apoptose de neutrófilos em cães nos diferentes estágios da LVC. No presente estudo, foi observado que a LVC aumenta a taxa de apoptose dos neutrófilos nos estágios finais da infecção (Figura 2), o que ocorre após ativação do metabolismo oxidativo em estágios anteriores da doença (Figura 1). É razoável supor que a maior produção de ERO decorrente da ativação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos no estágio inicial da LVC possa ter contribuído para o aumento da taxa de apoptose observada no estágio final da doença, conforme já demonstrado (KANNAN; JAIN, 2000). Neste sentido, Bildik et al. (2004) comprovaram que cães com LVC sofrem estresse oxidativo capaz de aumentar

a peroxidação lipídica plasmática. Segundo Anwar e Whyte (2007), quando a produção de ERO gerada pela ativação do metabolismo oxidativo excede a capacidade antioxidante da célula, o processo de apoptose é desencadeado e, uma vez iniciado, a célula se torna menos funcional. Reforçando tal hipótese, tratamentos à base de antioxidantes têm gerado bons resultados em pacientes humanos portadores de leishmaniose (SEN et al., 2000; PAULA-JUNIOR et al., 2006).

Há de se considerar também que o aumento da apoptose dos neutrófilos no estágio muito severo da LVC ocorre concomitantemente a achados laboratoriais que caracterizam os cães desse grupo como urêmicos portadores de DRC (Tabela 1). Recentemente, nosso grupo de pesquisa confirmou que em neutrófilos de cães com uremia ocorre aumento da apoptose espontânea (SILVA et al., 2012) e inibição do metabolismo oxidativo (BARBOSA et al., 2010). A diminuição da produção de superóxido em animais urêmicos, sem necessariamente estar relacionada à leishmaniose, também já foi demonstrada em gatos (KEEGAN; WEBB, 2010) e humanos (PAUL et al., 1991). Na uremia, as toxinas urêmicas comprovadamente induzem ao aumento da apoptose espontânea dos neutrófilos humanos (COHEN et al., 2001; JABER et al., 2001; MAJEWSKA et al., 2003). Tais achados contribuem para a hipótese de que a uremia presente no estágio muito severo da LVC, e não necessariamente a leishmaniose, causa inibição do metabolismo oxidativo e aumento da apoptose neutrofílica.

Cendoroglo et al. (1999) justificaram que a disfunção neutrofílica observada na uremia se deve ao fato de os neutrófilos, no início da DRC, apresentarem um aumento do metabolismo oxidativo, de forma que as substâncias oxidantes superam a capacidade antioxidante da célula. Isso levaria ao estresse oxidativo da célula, lesionando estruturas celulares vitais e desencadeando o processo de apoptose celular, comprometendo assim o metabolismo oxidativo em estágios avançados e predispondo os indivíduos nos estágios finais da DRC a infecções. Tal explicação também serviria para justificar, pelo menos em parte, a maior taxa de apoptose obtida no estágio

muito severo no presente estudo. No estágio moderado da LVC ocorre ativação do metabolismo oxidativo, o que levaria à depleção das defesas antioxidantes dos neutrófilos e desencadearia a apoptose, conforme observada pela maior taxa de apoptose no estágio muito severo da infecção.

Portanto, é razoável supor que a disfunção neutrofílica observada no presente estudo possa ser resultado do efeito somatório do estresse oxidativo causado pela infecção e pela condição urêmica que caracteriza o estágio muito