Neste trabalho estendemos o estudo sobre as vacinas de DNA HIVBr27 e HIVenv7, previamente descritas em minha dissertação de mestrado. Demonstramos que a imunização com HIVBr27 induz uma resposta imune celular mediada por linfócitos T CD4+ e CD8+ contra peptídeos de diferentes subtipos do HIV-1. Além disso, a imunização com HIVBr27 mostrou-se parcialmente protetora contra a infecção pelo vírus Vaccinia recombinante codificando as proteínas Gag e Pol do HIV-1. Ensaios in
vitro demonstraram que os peptídeos codificados pela HIVBr27 se ligam a múltiplas
moléculas HLA de classe II e são reconhecidos por células de pacientes infectados pelo HIV-1. Demonstramos também que a vacina HIVenv7 não possui propriedades imunossupressoras consistentes, contrariando os resultados obtidos previamente. Os peptídeos codificados pela HIVenv7 se ligaram a múltiplas moléculas HLA de classe II, mas apresentaram baixa frequência de reconhecimento por células de pacientes infectados pelo HIV-1.
Em nosso trabalho prévio demonstramos que a vacina HIVBr27 induzia uma resposta imune celular ampla e polifuncional contra peptídeos do HIV-1, mediada tanto por linfócitos T CD4+ quanto CD8+. Aqui demonstramos que essa resposta imune celular também se direciona a peptídeos de diferentes subtipos virais, o que vai de encontro à nossa hipótese inicial. De fato, ao construir a vacina HIVBr27, utilizamos a sequência consenso do grupo M do HIV-1 com o objetivo de induzir uma resposta cruzada contra as diversas variantes do vírus, sugerida como uma das alternativas para a proteção contra a diversidade global do HIV-1 (132).
Acreditamos que nossa estratégia vacinal trouxe melhorias significativas no que se diz respeito ao uso de sequências consenso do grupo M do HIV-1. Enquanto a HIVBr27 foi desenhada para codificar epitopos altamente conservados e promíscuos,
reconhecidos principalmente por linfócitos T CD4+ e provenientes de 7 proteínas virais diferentes, outros estudos se focaram apenas na indução de respostas cruzadas contra o envelope viral (133-135). Apesar dos estudos mencionados apresentarem resultados importantes quanto à indução de respostas imunes celulares e humorais contra diferentes subtipos virais, acreditamos que o foco em apenas uma proteína viral poderia não ser suficiente para combater a infecção.
Diferentes estratégias vacinais têm sido desenvolvidas para superar a diversidade genética do HIV-1. Uma vacina baseada em um vetor adenovírus 26 codificando mosaicos das proteínas Gag, Pol e Env mostrou-se mais imunogênica do que uma vacina similar codificando proteínas do consenso M do HIV-1 em macacos resos (120). Entretanto, é importante notar que as vacinas desse estudo foram baseadas em proteínas inteiras do HIV-1, ao contrário de nossa estratégia multiepitópica. Outro estudo, baseado em proteínas quiméricas compostas de regiões conservadas de Pol, Gag, Vif e Env dos subtipos A, B, C e D do HIV-1 (122), induziu respostas significativas de linfócitos T CD8+, mas respostas bem limitadas de linfócitos T CD4+, quando comparamos à nossa vacina HIVBr27. De fato, a nossa vacina foi a primeira construção especificamente desenhada para induzir respostas de linfócitos T CD4+ amplas e cruzadas entre os diversos subtipos virais. Acreditamos que nossa vacina pode conferir uma resposta antiviral diretamente desempenhada por linfócitos T CD4+, assim como auxiliar vacinas indutoras de respostas mediadas por linfócitos T CD8+.
Acredita-se que vacinas multiepitópicas, como a HIVBr27, facilitam a emergência de peptídeos individualmente imunogênicos, contribuindo para a indução mais eficiente de respostas imunes celulares amplas (136-138). Entretanto, esse tópico é ainda controverso. Enquanto a imunização de camundongos e macacos com vacinas de DNA codificando fragmentos da proteína Gag do HIV-1 se mostrou mais eficiente na
indução de respostas imunes amplas, em dois estudos independentes (139, 140), um terceiro estudo demonstrou que a imunização de macacos em regime de prime-boost com os vetores adenovírus 35 e 26, codificando a proteína Gag inteira, induziu uma resposta de maior magnitude e de amplitude semelhante quando comparada ao mesmo sistema vacinal codificando fragmentos da proteína (141). É possível que diferenças entre vacinas de DNA e vetores virais tenham contribuído para os resultados discrepantes. Acreditamos que um estudo envolvendo diferentes vetores e proteínas seria interessante para determinar a melhor maneira de se induzir respostas imunes celulares de grande amplitude.
Um ponto importante da nossa construção vacinal é a presença de regiões conservadas do HIV-1. Além de promover uma resposta cruzada entre os subtipos, como discutido anteriormente, acredita-se que essas regiões sejam propícias a um menor escape imunológico por mutações e por isso, promovam uma maior proteção contra a infecção. Neste contexto, um estudo recente demonstrou que a imunização de indivíduos não infectados pelo HIV-1 com um regime vacinal de prime-boost composto por uma vacina de DNA, um adenovírus símio e o vírus Vaccinia Ankara modificado codificando regiões virais conservadas, induziu altos níveis de linfócitos T CD8+ citotóxicos contra porções subdominantes de Gag e Pol. Essas células foram capazes de reconhecer linfócitos T CD4+ autólogos e inibir em quase 6 logs a replicação viral in
vitro (142). Em outro estudo, a imunização de indivíduos não infectados com
adenovírus 35 codificando as proteínas Gag, transcriptase reversa, integrase, Nef e Env do subtipo A do HIV-1 induziu respostas tanto contra regiões variáveis quanto conservadas dessas proteínas. Entretanto, as respostas direcionadas contra regiões conservadas foram aquelas capazes de inibir de forma mais eficaz a replicação in vitro de vírus provenientes de múltipos clados do HIV-1 (143).
A fim de avaliar se a resposta imune induzida pela vacina HIVBr27 era de fato antiviral, desafiamos camundongos imunizados com o vírus Vaccinia modificado, codificando as proteínas Gag e Pol do HIV-1 (Vaccinia Gag-Pol). A inabilidade do HIV-1 em infectar camundongos torna difícil o estabelecimento de modelos de desafio. Entretanto, julgamos nossa escolha como suficiente para a prova de conceito pretendida. Observamos que a imunização com HIVBr27 levou à redução da carga viral em três vezes. Se comparada a um estudo anterior (144), essa proteção pode ser considerada pequena. No estudo mencionado, a imunização de camundongos com uma vacina de DNA codificando Gag p41 do HIV-1 fusionada a um anticorpo anti-DEC205 (receptor de células dendríticas) protegeu de forma eficaz contra o desafio com vírus Vaccinia modificado codificando Gag p41 do HIV-1, reduzindo a carga viral em 2 a 4 logs, dependendo da dose vacinal. Entretanto, em um estudo mais recente também focado no direcionamento de antígenos a células dendríticas, foi observado que a imunização com uma vacina de DNA codificando Gag p24 do HIV-1 fusionada à proteína PD1 (programmed death 1) levou a uma proteção contra o vírus Vaccinia Gag-Pol semelhante à obtida com HIVBr27 (145). Portanto, não podemos subjulgar a proteção induzida pela HIVBr27. Acreditamos que uma formulação vacinal otimizada com a inclusão de um adjuvante potente, como feito nos estudos mencionados acima, poderia aumentar a capacidade protetora de nossa vacina.
No momento da construção das vacinas HIVBr27 e HIVenv7 buscávamos selecionar peptídeos conservados do HIV-1 que fossem ligadores em potencial a múltiplas moléculas HLA-DR, com o intuito de induzir uma resposta imune de grande cobertura populacional. Nesse trabalho mostramos que os peptídeos selecionados pelo algoritmo TEPITOPE (126) se ligam de fato a múltiplas moléculas HLA-DR, sendo que os peptídeos codificados pela HIVBr27 se ligaram a 12 das 17 moléculas testadas e os
peptídeos codificados pela HIVenv7 se ligaram a 11 dessas moléculas. As moléculas HLA-DR se ligaram em média a 19 peptídeos da HIVBr27 e 5 peptídeos da HIVenv7. Além disso, observamos ligação dos peptídeos vacinais a múltiplas moléculas HLA-DP e HLA-DQ e a moléculas de classe II murinas. É importante notar que os peptídeos vacinais se ligaram a algumas moléculas HLA de classe II associadas a proteção contra AIDS, como HLA-DRB1*0101, -DRB3*0202, -DRB1*13 e -DQB1*06 (146, 147). Portanto, consideramos que os peptídeos vacinais possuem potencial de induzir respostas imunes de grande cobertura vacinal, muitas vezes restritas a moléculas HLA de classe II associadas à proteção contra a progressão da doença.
Os peptídeos codificados pela vacina HIVBr27 se mostraram antigênicos no contexto da infecção natural pelo HIV-1. Observamos que 72% dos pacientes reconheceram pelo menos um peptídeo vacinal e que 16 dos 27 peptídeos foram reconhecidos. As respostas mostradas aqui foram similares às obtidas por nosso grupo, quando se avaliou o reconhecimento de peptídeos do subtipo B do HIV-1 por células de pacientes infectados clinicamente semelhantes aos participantes do presente estudo (127). Os peptídeos codificados por HIVenv7 apresentaram baixa frequência de reconhecimento, o que está em concordância com nossos resultados prévios de imunogenicidade dessa vacina em camundongos BALB/c, no qual as respostas foram bastante limitadas, com apenas um peptídeo sendo imunogênico.
Assim como feito no presente trabalho, um estudo anterior avaliou o reconhecimento de peptídeos de Gag provenientes do consenso do grupo M do HIV-1 por pacientes infectados (148). Nesse caso, 34% dos peptídeos de 15 aminoácidos utilizados foram reconhecidos por pacientes infectados pelo subtipo B viral, enquanto nós observamos que 44% de nossos peptídeos foram reconhecidos por pacientes infectados pelo mesmo subtipo do vírus. Se considerarmos apenas os peptídeos de Gag
codificados pela HIVBr27, temos 50% dos mesmos sendo reconhecidos por pacientes infectados pelo subtipo B do HIV-1. Isso sugere que os peptídeos conservados e promíscuos identificados com o auxílio do algoritmo TEPITOPE apresentam alguma vantagem em seu reconhecimento por células provenientes de pacientes infectados quando comparados a peptídeos de 15 aminoácidos corriqueiramente utilizados em ensaios de identificação de resposta celular.
No presente trabalho pretendíamos também estender os estudos sobre a vacina HIVenv7 no que se diz respeito às suas propriedades imunossupressoras. Em nosso trabalho prévio mostramos que a co-imunização de HIVenv7 e HIVBr27 levava à redução da resposta imune celular induzida por HIVBr27. Aqui demonstramos que a vacina HIVenv7 não apresenta tais propriedades, não sendo observada a redução de forma consistente da resposta imune induzida pela vacina pVAXGag quando co- imunizada com HIVenv7. Ao analisar experimentos de co-imunização isolados, observamos em alguns casos uma redução da resposta de pVAXGag, porém, ao considerarmos todos os experimentos, os resultados acabaram não sendo significativos. Ainda para confirmar os dados obtidos em nosso trabalho prévio, co-imunizamos HIVBr27 com HIVenv7 novamente. Nesse caso, utilizamos como controle a co- imunização de HIVBr27 com uma HIVenv7 modificada, codificando os mesmos peptídeos, porém com os aminoácidos embaralhados. Contrário ao observado anteriormente, em que o controle foi a co-imunização de HIVBr27 com pVAX1 vazio, não houve redução da resposta induzida pela HIVBr27.
As proteínas gp120 e gp41 do envelope do HIV-1, assim como alguns de seus peptídeos, foram descritos como imunossupressoras. De fato, foi observado que o pré- tratamento de clones de linfócitos T específicos para o toxóide de tétano com gp120 era capaz de inibir a produção de IL-2 e a proliferação dessas células frente ao estímulo
específico, fato esse relacionado à supressão da translocação de PKC e à redução de fosfatos de inositol e cálcio intracelular (149). A inibição da resposta in vitro de linfócitos T CD4+ ao estímulo com IL-2 também foi observada, sendo relacionada à falta de ativação da via Jak/STAT nessas células após tratamento com as proteínas gp120 e gp41 em conjunto (150). Indícios da interferência de peptídeos do envelope do HIV-1, como o gp160(579-604) e o gp160(499-511), na proliferação tanto de linfócitos T CD4+ quanto CD8+, induzida por diferentes estímulos, como anticorpos anti-CD3, Concanavalina A e IL-2, foram também obtidos por outros grupos (151, 152).
O conjunto de trabalhos sobre propriedades imunossupressoras do envelope do HIV-1 apresentado acima deu suporte à nossa hipótese inicial de que o fenômeno observado na co-imunização de HIVBr27 e HIVenv7 se devia a isso. Entretanto, a falta de consistência dos nossos resultados nos leva a acreditar que o ocorrido inicialmente se devia a problemas técnicos ou a outro fenômeno não relacionado à imunossupressão. De fato, a interferência na resposta imune induzida por plasmídeos foi previamente observada em estudos que avaliavam a imunogenicidade de vacinas de DNA administradas em conjunto (153, 154). Foi sugerido em um dos estudos que a competição entre plasmídeos pela maquinaria de transcrição celular pode levar à redução da expressão proteica de cada plasmídeo e, consequentemente, da resposta imune induzida pelos mesmos. Portanto, acreditamos que a co-imunização com vacinas de DNA deve ser seguida de estudos detalhados sobre as possíveis interferências entre seus componentes. Isso pode trazer informações importantes para a formulação de vacinas mais imunogênicas.