3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.2. Kimyasal Sentezler ve Karakterizasyon
Bu çalışmada sentezi yapılan bileşiklerin bazıları literatürde yer alan metotlara göre, bazıları ise daha önceki metodların modifiye edilmesi sonucunda yeni metod geliştirerek toplamda 12 bileşik sentezlenmiştir.
Şekil 3.1: 4 no’lu kaliks[4]aren bileşiğinin sentez şeması
3.2.1. 5,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrahidroksikaliks[4]aren (1) Gutsche ve Iqbal, 2003
1000 ml ikiboyunlu balona 100 g (0,665 mol) p-ter-bütilfenol, %37 lik HCHO 62,3 mL (0,83 mol) ve 1,2 g (0,03 mol) NaOH çözeltisi eklendi. Reaksiyon karışımı yağ banyosunda sabit 110-120 0C da ksilol cihazı takılarak geri soğutucu ve azot gazı altında 1,5-2 saat ısıtıldı. Bu işlem sırasında reaksiyon karışımı viskoz bir hale gelerek önce turuncu renge ardından katı sarı kütle haline çevrildi ve sıcaktık kapatılarak oda sıcaklığına kadar soğutuldu. Daha sonra 800-1000 mL difenil eter eklendi ve ksilol cihazı, azot gazı takılarak yeniden ısıtıldı. Suyun ortamdan uzaklaşması ve reaksiyon karışımının berraklaşması beklendi. Su çıkışı bittikten sonra karışıma geri soğutucu takıldı ve 1,5-2 saat daha kaynatıldı. Süre sonunda reaksiyon karışımı oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakıldı. Reaksiyon karışımı soğuduğunda 1L etil asetat eklenerek çöktürme işlemi yapıldı. Çöktürülen madde vakuum altında süzme işlemi yapılarak 200 mL etil asetat, 200 mL asetik asit ve son olarak pH-7 olacak şekilde saf su ile yıkandı ve kurutuldu. Kurutulan 66,5g (% 62) ham ürün toulen ile tekrar kristallendirildi ve 61,6 g parlak ve beyaz kristal formda, erime noktası 343-3440C (lit., 344-3460C) ürün elde
edildi (Gutsche ve Iqbal, 2003). 1H-NMR (400 MHz CDCl3) δ (ppm): 1.20 (s, 36H, But), 3.45 (d, 4H, ArCH2Ar), 4.25 (d, 4H, ArCH2Ar), 7.05 (s, 8H, ArH), 10.35 (s, 4H, OH).
3.2.2. 5,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi kaliks[4]aren (Arnaud-Neu ve ark., 1989)
p-ter-Bütilkaliks[4]aren 5 g (7.71 mmol) ile potasyum karbonat 1.29 g (9.4
mmol) 250 mL aseton ortamında geri soğutucu altında 2 saat kaynatılarak karıştırıldı. Süre sonunda metilbromasetat 1.48 mL (16.19 mmol) ilave edilerek 24 saat daha kaynatılarak karıştırıldı. Reaksiyon ince tabaka kromotogrofisi ile takip edilerek sonlandırıldı ve çözücü vakum altında uzaklaştırıldı. Kalan katı etanol içerisinde kristallendirildi. Verim % 65, E.n. 180-1820C (lit. 182-1840C). IR: 3424 cm-1(OH), 1757 cm-1(C=O). 1H NMR (CDCl3) δ (ppm): 0.98 (s, 18H, But), 1.28 (s, 18H, But), 3.35 (d, 4H, J=14.6 Hz, ArCH2Ar), 3.85 (s, 6H, OCH3), 4.45 (d, 4H, J=14.6 Hz, ArCH2Ar), 4.55 (s, 4H, OCH2), 6.80 (s, 4H, ArH), 6.98 (s, 2H, OH), 7.05 (s, 4H, ArH).
3.2.3. 5,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dihidrazonamid karbonilmetoksi-26-28- dihidroksi-kaliks[4]aren (Maity ve ark., 2011)
2 no’lu bileşik (0.79 g, 1 mmol) ve 2 mL 80 % hidrazin hidrat çözeltisi
sonunda çözücü uzaklaştırıldı ve kurutuldu. Kurutulan katı madde hekzanla bir kaç kere yıkandı ve yeniden kurutuldu. Verim 0.75 g (% 90), E.n: 245-246 oC. IR: 1677 cm–1 (C=O). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1.27 (s, 18H, But), 1.02 (s, 18H, But), 3.44 (d, 4H, J = 13.5 Hz, ArCH2Ar), 4.11 (d, 4H, J = 13.5 Hz, ArCH2Ar), 4.65 (s, 4H,- OCH2CO), 6.93 (s, 4H, Ar-H), 7.08 (s, 4H, Ar-H), 7.80 (s, 2H, –CONH), 9.70 (s, 2H, - OH). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ (ppm) 167,50, 149.43, 148.19,143.19, 132.26, 126.94, 126.21, 125.72, 74.21, 34.19, 33.91, 31.94, 31.63, 30.98.
i3.2.4. 4 no’lu bileşiğin sentezi
3 no’lu bileşik (0,2 g; 0,25 mmol) dikorometanda çözüldü ve üzerine 10 ml
diklorometan içerisinde çözülmüş 1,3-dibenzooksodiazol (NBD) bileşiği (0,11 g; 0,55 mmol) eklendi. Reaksiyon karışımına sodyum karbonat (0,14 g; 1,37 mmol) eklenerek 6 saat karıştırıldı. Reaksiyon ince tabaka kromotografisi ile takip edilerek sonlandırıldı. Çözücü evaparatörde uzaklaştırıldı ve geriye kalan katı madde dietileterde bir kaç kere yıkandı ve yeniden kurutuldu. Katı kiremit renkli madde flaş süzme yapılarak kurutuldu. Verim % 85, IR: 1317 cm-1 (NO2) ve 1525 cm-1 (NO2). 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ (ppm) 1.07 (bs, 18H, But), 1.22 (bs, 18H, But), 3.81 (bs, 4H, ArCH2Ar), 4.26 (bs, 4H, ArCH2Ar), 4.86 (bs, 4H-OCH2CO), 7.36 (s, 8H, Ar-H), 8.02 (bs, 2H, Ar- HNBD), 8.41-8.54 (m, 2H, –CONH), 8.67 (bs, 2H, Ar-HNBD), 11.06 (s, 2H, -OH). 13C- NMR (100 MHz, DMSO):δ (ppm) 167,66, 150.04, 143.86, 142.28, 136.00, 133.45, 133.00, 131.01, 129.26, 127.56, 126.05, 73.58, 34.55, 34.12, 31.82, 31.33.
Şekil 3.2: 8 no’lu kaliks[4]aren bileşiğinin sentez şeması
3.2.5. 5,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrahidroksikaliks[4]aren’nin dealkilasyonu (Gutsche ve Iqbal, 2003)
p-ter-Bütilkaliks[4]aren 52.4 g (70,71 mmol) 675 mL kuru toluen ile çözülüp 2
saat oda sıcaklığında karıştırıldı. Süre sonunda önce 32 g (340 mmol) fenol, daha sonra AlCl3 üç adımda 76 g (570 mmol) 15 dk aralıklı ilave edildi. En son 4 saat boyunca azot atmosferinde oda sıcaklığında karıştırılmaya bırakıldı. Süre sonunda 0.2 N HCl eklendi ve sulu ve organik faz ayrılarak nötralleştirildi. Alınan organik faz MgSO4 ile kurutuldu
ve oluşan sarı çözelti distille edildi. Son olarak 500 mL metanol ilave edildi ve çöken bej renkli ürün süzülerek kurutulmaya bırakıldı. Katı madde CHCl3-CH3OH varlığında kristallendirilir ve %78 verimle beyaz renkli kristaller elde edildi. E.n: 313-315 oC. 1H- NMR (400 MHz CDCl3) δ (ppm): 4,23 (d, 4H, J = 13 Hz, ArCH2Ar), 4,23 (d, 4H, J =
13 Hz, ArCH2Ar), 6,67 (t, 4H, J=7,44 Hz, ArH), 7,45 (d, 8H J=7,56 Hz, ArH), 10,16 (s, 4H, OH).
3.2.6. 25,27-dimetoksikarbonilmetoksi-26,28-dihidroksikaliks[4]aren (Arnaud-Neu ve ark., 1989)
6,16 g (15,00 mmol) kaliks[4]aren 250 mL kuru aseton içerisinde çözüldü. Üzerine 2,23 g (16,0 mmol) K2CO3 ilave edilerek 30 dakika karıştırılırdı. Daha sonra bu karışıma 4,87 g (31,5 mmol) BrCH2COOCH3 eklendi ve reaksiyon 24 saat kaynatıldı. Bu süre sonunda çözücü uzaklaştırıldı, oluşan katı madde metanol ile yıkandı. Verim %75. E.n.:214-215 oC. IR (cm-1): 1760 (C=O). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3.40 (d, J=13.0 Hz, ArCH2Ar), 3.85 (s, 6H, CH2CO2CH3), 4.45 (d, J=13.0 Hz, ArCH2Ar), 4.73 (s, 4H, CH2CO2CH3), 6.65 (t, 2H, J=7.6 Hz, ArH), 6.73 (t, 2H, J=7.6 Hz, ArH), 6.89 (d, 4H, J=7.6 Hz, ArH), 7.10 (d, 4H, J=7.6 Hz, ArH), 7.52(s, 2H, ArOH).
3.2.7. 25,27-dihidrazonamid karbonilmetoksi-26-28- dihidroksi-kaliks[4]aren (Maity ve ark., 2011)
6 no’lu bileşik (3 g, 4x10-3 mmol) ve 2 mL % 80 hidrazin hidrat çözeltisi toluen/metanol (1:1, 200 mL) karışımında 8 saat karıştırılarak kaynatıldı. Bu süre sonunda çözücü uzaklaştırıldı. Süzülen katı madde hekzan ile yıkandı ve vakumda kurutuldu. Verim %70, IR: 1662 cm–1 (C=O). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3.54 (d, 4H, J = 13.5 Hz, ArCH2Ar), 4.19 (d, 4H, J = 13.5 Hz, ArCH2Ar), 4.70 (s, 4H,– OCH2CO), 6.76 (t, 2H, J =7.3 Hz, Ar-H), 6.87 (t, 2H, J =7.3 Hz, Ar-H), 6.98 (d, 4H, J =7.3 Hz, Ar-H), 7.11 (d, 4H, J =7.3 Hz, Ar-H ), 7.8(t, 2H, –CONH), 9.70 (s, 2H, –OH).
3.2.8. 8 no’lu bileşiğin sentezi
1,3-dibenzooksodiazol bileşiği (NBD) (0,15 g; 0,77 mmol) diklorometanda çözüldü ve üzerine 7 no’lu bileşik (0,2 g; 0,35 mmol) diklorometan ortamında çözülerek eklendi. Reaksiyon karışımına sodyum karbonat (0,2 g; 1,93 mmol) eklenerek 6 saat karıştırıldı. Reaksiyon ince tabaka kromotografisi ile takip edilerek sonlandırıldı. Çözücü uzaklaştırıldı ve dietileter eklenerek karıştırıldı. Çöken kiremit renkli madde süzüldü ve kurutuldu. Verim % 80, IR: 1320 cm-1 (NO2) ve 1519 cm-1 (NO2). 1H NMR (400 MHz,
DMSO): δ (ppm) 3.81 (bs, 4H, ArCH2Ar), 4.59 (bs, 4H, ArCH2Ar), 4.90 (s, 4H- OCH2CO), 6.83 (s, 2H, Ar-H), 6.61 (s, 2H, Ar-H), 7.07-7.16 (m, 8H, Ar-H), 7.82- 8.25(m, 4H, Ar-HNBD + NH-CO), 8.67 (bs, 2H, Ar-HNBD), 11.29 (s, 2H, -OH). 13C- NMR (100 MHz, DMSO):δ (ppm) 167,61, 152.62, 150.03, 143.83, 142.94, 135.95, 134.04, 131.01, 129.67, 129.22, 128.00, 73.56, 55.39, 31.16.
3.2.9. 5,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi
kaliks[4]aren ile etilendiamin’in etkileştirilmesi (Ostaszewski ve ark., 1991)
2.5 g (3.15 mmol) p-ter-bütil-kaliks[4]aren dimetil ester türevi 100 ml kloroform ve 100 mL metanol içerisinde çözüldü ve 1.265 mL (18.94 mmol) etilendiamin ilave edilerek 16 saat oda sıcaklığında karıştırıldı. Bu süre sonunda çözücü evoparatörde uzaklaştırıldı. Katı kısım metanolde kristallendirildi. Verim % 82, E.n. 328-329 oC (lit. >300), (Ostaszewski ve ark., 1991). 1H NMR (CDCl3) δ (ppm): 1.16 (s, 18H, But), 1.25 (s, 18H, But), 3.49 (d, 4H, J=13 Hz, ArCH2Ar), 3.68 (m, 4H, CH2-NH), 4.25 (d, 4H,
J=13 Hz, ArCH2Ar), 4.54 (s, 4H, OCH2), 7.05(s, 8H, ArH), 8.31 (s, 2H, OH), 8.60 (t, 2H, NH).
3.2.10. 9 no’lu bileşiğin hekzametilentetraamin ile etkileştirilmesi (Chawla ve ark., 2006)
1 g (1.26 mmol) 9 no’lu bileşik ve 7.12 g (38.9 mmol) hekzametilentetraamin 60 mL TFA içerisinde çözülerek 45 saat kaynatılarak karıştırıldı. Reaksiyon tamamlandıktan sonra asitli suda çöktürüldü ve çöken katı ürün saf su ile pH 7 oluncaya kadar yıkandı. Bileşik 10 %78 verimle elde edildi. E.n. 231-233oC. 1H NMR (CDCl3) δ (ppm): 1.15 (s, 18H, But), 3.55 (d, 4H, J=13.6 Hz, ArCH2Ar), 3.70 (m, 4H, CH2-CH2), 4.18 (d, 4H, J=13.6 Hz, ArCH2Ar), 4.55 (s, 4H, OCH2), 7.10 (s, 4H, ArH), 7.65 (s, 4H, ArH), 9.18 (s, 2H, NH), 9.80 (s, 2H, CHO).
3.2.11. 1,3-dibenzooksodiazol bileşiğinin hidrazin ile etkileştirilmesi (Meng ve ark., 2015a)
0.1 g (0.5 mmol) 1,3-dibenzooksodiazol bileşiği (NBD) 50 ml kloroformda çözüldü. Daha sonra çözeltiye 50 ml metanol içerisinde çözünmüş 0.77 ml % 80 hidrazin hidrat ilave edildi. Reaksiyon karışımı 1 saat oda sıcaklığında karıştırıldı. Süre sonunda oluşan katı süzüldü ve kloroformda yıkandı. IR: 1254 cm-1 (C-N), 1617 cm-1 (NH2), 3369 cm-1 (N-H). 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ (ppm) 5.46-6.23 (bs, 1H, Ar- HNBD) 6.45-7.53 (m, 3H, NH-NH2), 8.02 (s, 1H, Ar-HNBD).
3.2.12. 12 no’lu bileşiğin sentezi
0.19 g (0.26mmol) 10 nolu bileşik kloroformda çözüldü ve bu çözeltiye 0.1 g (0.59 mmol) 11 nolu bileşik metanolda çözülerek eklendi. Reaksiyon karışımı 48 saat süre boyunca kaynatıldı ve ince tabaka kromotografisi ile takip edilerek sonlandırıldı. Daha sonra çözücü evaparatörde uzaklaştırıldı. Geriye kalan katı kısım kloroform ve saf su karışımında ekstraksiyon yapıldı. Daha sonra organik faz MgSO4 kullanılarak kurutulduktan sonra çözücü evaparatörde uzaklaştırıldı ve katı madde elde edildi. Verim % 40, IR: 1687 cm-1 (C=N). 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ (ppm) 1.12-1.49 (s, 18H, But), 3.50 (bs, 4H, ArCH2Ar), 3.63 (bs, 4H, CH2-CH2), 4.19 (bs, 4H, ArCH2Ar), 4.50 (bs, 4H,-OCH2CO), 7.31 (bs, 4H, Ar-H), 7.74 (bs, 4H, Ar-H), 8.50 (m, 4H, Ar-HNBD + NH-Ar), 9.05 (s, 2H, Ar-HNBD). 13C-NMR (100 MHz, DMSO):δ (ppm) 167.62, 161.14, 160.28, 155.14, 154.53, 148.80, 147.17, 143.48, 133.24, 132.84, 129.86, 128.97, 127.89 126.68, 75.12, 38.96, 34.83, 31.55.
3.2.13. Kaliks[4]aren türevlerinin hücre içi görüntülemesi
Sentezlenen 4, 8 ve 12 no’lu kaliks[4]aren türevlerinin hücre içi lokalizasyonlarının belirlenmesi amacıyla A549 (akciğer kanseri) hücresi cam tabanlı 24 kuyucuklu plakalar üzerinde 24 saatlik 37°C de % 95 nem ve %5 CO2 li ortamda büyütüldü. İnkübasyondan sonra hücreler üzerine 10 µM olacak şekilde her bir bileşik eklenerek 45 dakika inkübe edildi ve daha sonra PBS ile yıkanarak hücre içine girmeyen fazla kompleks uzaklaştırıldı. İnkübasyondan sonra hücre görüntülemesi konfokol mikroskobu ile görüntülendi.