Kasılma Tiplerine Göre Kas Lifi Tiplerinin Belirlenmesi

Kas lifi tiplerinin belirlenmesinde Myosin ATPase boyama tekniğinden yararlanılmıştır. Bu analiz sonunda kuzularda bulunan üç farklı tip kas lifi farklı renklere boyanarak, bu şekilde kas lifi tipleri belirlenmiş ve birbirlerinden ayrılmıştır.

3.5.1.1. Myosin ATPase Analizinde Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı 3.5.1.1.1 1 N Sodyum Hidroksit (NaOH) Hazırlanması

40 gr NaOH (Sigma, S-8045) tartılmış ve üzerine 150 ml çift distile su ilave edilerek manyetik karıştırıcı yardımıyla iyice çözünmesi sağlanmıştır. Elde edilen çözelti oda sıcaklığında depolanmıştır.

3.5.1.1.2. 1 N Formik Asitin Hazırlanması

37.73 ml Formik asit ( Sigma, F-0507) üzerine 962,27 ml çift distile su ilave edilerek 1 lt’ye tamamlanmıştır ve manyetik karıştırıcıda iyice karışması sağlanmıştır. Elde edilen karışım oda sıcaklığında depolanmıştır.

3.5.1.1.3. 0.1 M Tris Hazırlanması

Molekül ağırlığı 121.14 g olan Tris (Sigma T-1503)’den 12.11 gr tartılmıştır ve üzerine 1 lt çift distile su ilave edilerek manyetik karıştırıcıda iyice çözünmesi sağlanmıştır. Bu çözelti ise +4 °C de depolanmıştır.

3.5.1.1.4. 18 mM Kalsiyum Kloridin (CaCl2) Hazırlanması

Molekül ağırlığı 147.02 g olan Klasiyum Klorid (Sigma C-4901)’den 2.646 g tartılarak üzerine 1 lt çift distile su ilave edilmiştir. Manyetik karıştırıcı yardımı ile Kalsiyum Klorid’in suda iyice çözünmesi sağlanmıştır. Elde edilen çözelti +4 °C de depolanmıştır.

3.5.1.1.5. 100 mM Tris ve 18 mM Kalsiyum Klorid Karışımının Hazırlanması 12.11 g Tris (Sigma T-1503) ve 2.646 g Kalsiyum Klorid bir beher içerisine konularak üzerine 150 ml çift distile su ilave edilmiştir. Manyetik karıştırıcı yardımı ile bu

karışımın iyice çözünmesi sağlanmıştır. Daha sonra çift distile su ile bu karışım 1 lt’ye tamamlanmıştır. Bu işlemi takiben Hidroklorik Asit (HCl) kullanılarak bu karışımın pH’sı 7.8’e ayarlanmıştır. Elde edilen bu karışım +4 °C ’de depolanmıştır.

3.5.1.1.6. %1’lik Kalsiyum Kloridin (CaCl2) Hazırlanması

10 g Kalsiyum Klorid (Sigma C-4901) tartılarak 1 lt çift distile su içerisinde iyice çözünmesi sağlanmıştır. Elde edilen çözelti oda sıcaklığında depolanmıştır.

3.5.1.1.7. %2’lik Kobalt Klorürün (CoCl2.6H2O) Hazırlanması

2 g Kobalt Klorür (Sigma C-8661) tartılarak 100 ml çift distile su içerisinde çözünmesi sağlanmıştır. Elde edilen çözelti oda sıcaklığında depolanmıştır.

3.5.1.1.8. İnkübasyon Çözeltisinin Hazırlanması

18 mM Kalsiyum Klorid (185 mg, Sigma C-4901), 2.7 mM ATP (104 mg, Sigma A- 2385) ve 5.5 mM Tris (0.672 mg, Sigma T-1503) tartılarak bir beher içerisine konulup üzerine 70 ml çift distile su ilave edildikten sonra iyice çözünmesi sağlanmıştır. Daha 1N NaOH ile bu karışımın pH’sının 9.4 e ayarlanması sağlanmıştır.

3.5.1.1.9. %1’lik Amonyum Sülfid ((NH4)2S) Hazırlanması

700 μl Amonyum Sülfid (Fluka 09981) üzerine 70 ml çift distile su ilave edilerek hazırlanmıştır.

3.5.1.2. Myosin ATPase Boyama Tekniği İle Kas Lifi Tiplerinin Ayrılması

ATPase boyama yöntemi Brooke ve Kaiser’in (1970) bildirdiği metoda göre yapılmıştır. -80 °C’de depolanmış olan örnekler, iç sıcaklığı -24 °C olan Cryostat (SHANDON Thermo, Croyotome E) içerisine taşınarak burada 30 dakika süreyle bekletilmiştir. Daha sonra örneklerden yeteri büyüklükte bir parça alınarak bu parça üzerinden cryostat yardımı ile 10 µm kalınlığında örnekler lam üzerine alınmıştır. Lam üzerindeki örnekler oda sıcaklığında 30 dakika süreyle kurumaya bırakılmıştır. Bu sırada daha önce hazırlamış olduğumuz formik asitten bir behere 100 ml kadar koyup üzerine 1N NaOH

ilave ederek pH’sının 4.25’e ayarlanması sağlanmıştır. Bu pre-inkübasyon buffer’ı +4 °C’ye konulmuştur. 30 dakika süreyle kurumaya bırakılan lam üzerindeki örnekler bu süreç sonunda +4 °C’deki pre-inkübasyon buffer’a transfer edilmişlerdir. Örnekler burada 12 dakika süreyle muhafaza edilmiştir. Bu işlemi takiben örnekler 2 kez, 2 dakika süreyle daha önce hazırlanmış ve pH’sı 7.8 olan Tris-CaCl2çözeltisine transfer

edilmiştir. Daha sonra örnekler yine 2 defa 2 dakika süreyle çift distile suda yıkanmıştır. Daha önce hazırlanmış olan ve pH’sı 9.4 olan inkübasyon buffer örneklerin inkübasyona tabi tutulmasından kısa süre önce 37 °C deki etüv içerisine konularak sıcaklığının bu değere ulaşması sağlanmıştır. İnkübasyon buffer’ının sıcaklığı 37 0_C’ye

ulaşmasıyla birlikte örnekler bu buffer içerisine transfer edilerek etüv içerisinde 1 saat süreyle inkübasyona tabi tutulmuşlardır. Bu işlemi takiben örnekler 3 defa toplam süresi 10 dakika (3 dakika, 3 dakika ve 4 dakika) olacak şekilde %1’lik CaCl2 ile muamele

edilmiştir. Daha sonra örnekler yine 3 defa toplam süresi 10 dakika olacak şekilde çift distile su ile yıkanmıştır. Örnekler buradan daha önce hazırlanmış olan %2’lik CoCl2

içerisine transfer edilerek burada 3 dakika süreyle bekletilmişlerdir. Bu işlemi takiben örnekler 3 defa toplam süresi yine 10 dakika olacak şekilde yıkanmışlardır. Daha sonra ise örnekler 2 dakika süreyle %1’lik (NH4)2S ile muamele edilmişlerdir. Bu işlemi

takiben örnekler 10 dakika süreyle çeşme suyunda yıkanmışlardır. Daha sonra örnekler üzerinde kalan suyun dehidrasyonu için %100’lük, %95’lik, %80’lik etil alkol (Merck 631) ve %100 lük aseton (Merck 643) ile muamele edilmişlerdir. Dehidrasyon sonrası örnekler Kanada Balsam (Sigma C-1795) ile kaplanmış ve örneklerin üzeri lamel ile kapatılmıştır. Bu boyama yöntemi ile farklı renklere boyanan 3 adet kas lifi tipi belirlenmiştir. Bunlar tip I (siyah-yavaş kasılan), tip IIA (beyaz-orta hızda kasılan) ve tip IIB (kahverengi-hızlı kasılan) kas liflerdir (Şekil 3.4, Şekil 3.5, Şekil 3.6)

Şekil 3.4. ST kasında Myosin ATPase boyama ile belirlenen kas lifi tipleri (10×)

Şekil 3.6. SM kasındaki Myosin ATPase boyama ile belirlenen kas lifi tipleri (10×)

3.5.1.3. Lif Tiplerinin Sayılarının Belirlenmesi

Kasılma tipi bakımından ATPase boyama tekniği ile belirlenen Tip I, Tip IIA ve Tip IIB kas lifi tiplerinin görüntüleri 10× büyütmede Faz-kontrast mikroskop (Nikon Eclipse E 600) kullanılarak fotoğraflandırılmış ve bu fotoğraflar bilgisayara aktarılmıştır. Fotoğraflar üzerinden kas lifi tiplerinin sayımı Laica Q Win V3.4 Processing-Analysis Software programı kullanılarak yapılmıştır. Kas lifi sayımında her bir kasın farklı bölgelerinden yaklaşık 4 adet kesit alınmış ve Myosin ATPase analizi sonucunda her bir kesitten 1000 den az olmayacak sayıda bir kas lifi sayımı yapılmıştır.

3.5.1.4. Lif Tiplerinin Alanlarının Belirlenmesi

Kasılma tipi bakımından ATPase boyama tekniği ile belirlenen Tip I, Tip IIA ve Tip IIB kas lifi tiplerinin görüntüleri 10× büyütmede Faz-kontrast mikroskop (Nikon Eclipse E 600) kullanılarak fotoğraflandırılmış ve bu fotoğraflar bilgisayara aktarılmıştır. Fotoğraflar üzerinden kas lifi tiplerinin alanları Laica Q Win V3.4 Processing-Analysis Software programı kullanılarak belirlenmiştir. Kas liflerinin alanlarının belirlenmesinde her bir kasın farklı bölgelerinden yaklaşık 4 adet kesit alınmış ve her kesitten yeteri kadar kas lifinin alanı belirlenmiştir.

3.5.2. SDH Boyama Tekniği İle Kas Liflerinin Metabolik Tiplerinin Belirlenmesi