Gebelik Dönemi Beslemesi İle Fötal Kas Lifi Gelişimi Arasındaki İlişki.

MAMÁRIA DO PERÍODO SECO

3.6.1 Determinação da concentração hidrogeniônica – pH

A determinação da concentração hidrogeniônica da secreção láctea foi realizada utilizando-se um potenciômetro modelo DM-20 da Digimed, calibrado para a temperatura ambiente e em soluções com pH 6,86 e pH 4,01. Após a estabilização da temperatura das amostras, equilibrando-se com temperatura do ambiente, as amostras foram adequadamente homogeneizadas e submetidas à determinação do pH. Após cada determinação, procedeu-se a limpeza do eletrodo com água destilada e a sua secagem com lenço de papel.

3.6.2 Determinação dos valores de eletrocondutividade

Milku Mastitron, que mede a capacidade dos íons cloro, sódio e potássio existentes no leite de conduzirem corrente elétrica. Antes do início das determinações, o equipamento é calibrado com uma solução de cloreto de potássio a 0,1 N., à 25°C, e o valor lido no equipamento ajustado para 12,9 mS/cm.

As amostras de secreção láctea de cada glândula mamária eram depositadas diretamente no receptáculo do equipamento, em quantidade suficiente (aproximadamente 10 ml) para cobrir os eletrodos do receptáculo, permitindo que ocorresse a passagem de corrente elétrica, sendo a condutividade registrada, automaticamente, em um visor digital e o resultado expresso em mS/cm (miliSiemens por cm). Após a leitura, procedia-se à limpeza do equipamento com água destilada e a sua secagem com lenço de papel.

3.6.3 Determinação dos teores de cloretos

A determinação dos teores de cloretos na secreção láctea foi realizada utilizando-se o analisador de cloretos modelo 925 da Corning, por titulação coulométrica. O aparelho analisador de cloretos apresenta um circuito composto de eletrodos de prata que ao receberem uma corrente elétrica e liberavam íons de prata numa taxa constante e a reação com cloretos ocorria em meio ácido, por essa razão emprega-se um tampão ácido.

Após a calibração do equipamento, adicionavam-se 100 µl de leite numa solução tampão ácida, momento em que o equipamento era acionado e os íons de cloro presentes no leite reagiam com os íons de prata liberada no meio ácido, formando o cloreto de prata. Ao mesmo tempo era acionado um cronômetro. Nesta reação havia o consumo dos íons cloro, presentes na secreção láctea dissolvido na solução tampão. Consumidos os cloretos da secreção láctea apareceriam os íons de prata livres que seriam reconhecidos por um eletrodo específico que interromperia a corrente elétrica responsável pela liberação dos íons de prata, parando o cronômetro. O tempo registrado pelo cronômetro é diretamente proporcional ao conteúdo de cloreto na amostra analisada. Os resultados foram expressos em mMol/l e convertidos nessa pesquisa pelo fator de 3,55 para unidade expressa em mg/dl.

3.6.4 Determinação dos teores de lactose, gordura, proteínas e sólidos totais

As amostras de secreção láctea, antes do início da análise, eram mantidas em banho- maria à 38°C durante 15 minutos, homogeneizadas, manualmente, sendo as determinações dos teores de lactose, gordura, proteínas e sólidos totais na secreção láctea realizadas por radiação

infravermelha utilizando-se o equipamento BENTLEY 2000 da Empresa Bentley Instruments Inc.. Uma alíquota de secreção láctea, depois de ser aspirada pelo equipamento BENTLEY 2000, é exposta a uma fonte de radiação infravermelha provocando a emissão de um espectro de ondas, sendo que os constituintes da secreção láctea (lactose, gordura, proteína e sólidos totais) que apresentam pico máximo da absorbância entre 2 µm e 15 µm são identificados e quantificados pelo equipamento. Os resultados foram expressos em g/dl.

3.6.5 Determinação do índice cloretos/lactose

O índice cloreto/lactose foi obtido conforme preconizado por Vanlandinghan et al (1941) mediante a divisão do valor de cloretos expresso em mg/dl pelo valor da lactose expresso em mg/dl e multiplicado por 100, sendo os resultados apresentados em porcentagem (%).

Cloretos Índice =

Lactose * X 100

* Os valores de lactose expressos em g/dl devem, anteriormente à divisão, ser multiplicados por 1000 e assim transformados em mg/dl.

3.6.6 Prova de Schalm e Noorlander – California Mastitis Test (CMT)

A avaliação indireta da celularidade do leite de cada quarto mamário foi realizada pela prova descrita por Schalm e Noorlander (1957) e denominada de California Mastitis Test (CMT).

Desenvolvida a partir do Teste de Whiteside, essa prova baseia-se na capacidade que os agentes tensoativos aniônicos, como o alquilarisulfonato, têm em destruir as células somáticas do leite, liberando o ácido desoxirribonucleico (DNA) presente no núcleo dessas células, resultando no aumento da viscosidade e/ou gelificação da mistura do reativo com a amostra do leite. Para melhorar a visualização da prova, inclui-se um corante a base de púrpura de bromocresol que permite, também, avaliar o pH da amostra.

Para a realização da prova utilizaram-se placas especiais contendo quatro receptáculos e neles colocavam-se 2 ml de leite e 2 ml do reativo de CMT (FATEC ®), sendo a mistura homogeneizada, por aproximadamente 10 segundos, com movimentos circulares, para a seguir ser realizada a avaliação dos resultados, segundo o grau de intensidade da viscosidade desenvolvida. A interpretação desta prova foi apresentada no quadro 9, obedecendo as normas preconizadas por SCHALM et al. (1971).

Escore Descrição da Reação Interpretação dos resultados

- - -

Negativo

A mistura permanece líquida após a homogeneização dos componentes da reação

0 a 200.000 células/ml, das quais 0 a 25% são leucócitos

polimorfonucleares.

(+) - -

Traços

Discreto aumento da viscosidade, mas sem tendência à formação de gel, a maior viscosidade pode ser melhor observada pela inclinação da placa. Esta reação desaparece com a movimentação contínua do fluído

150.000 a 550.000 células/ml, das quais 30 a 40% são leucócitos polimorfonucleares.

+ - -

Fracamente positivo

Há aumento da viscosidade sem tendência a formação de gel, o que deixa o centro do receptáculo descoberto durante a movimentação da mistura. A interrupção dos movimentos circulares permite que a mistura se distribua sobre o receptáculo, cobrindo seu fundo.

400.000 a 1.500.000 células/ml das quais 40 a 60% são leucócitos polimorfonucleares.

+ + -

Nitidamente positivo

A mistura torna-se, imediatamente, viscosa com a formação de gel, que deixa o centro do receptáculo descoberto durante a movimentação. Quando os movimentos circulares são interrompidos a mistura se espalha de novo homogeneamente sobre toda a base do receptáculo, evidenciando-se estrias viscosas

800.000 a 5.000.000 de células/ml, das quais 60 a 70%

são leucócitos polimorfonucleares.

+ + +

fortemente positivo

Ocorre gelificação imediata e evidente com abaulamento convexo da superfície da mistura no centro do receptáculo, durante a movimentação. Geralmente, esse abaulamento se mantém, mesmo após cessados os movimentos de homogeneização. A viscosidade da mistura é tão espessa que adere ao fundo do receptáculo

Contagem celular maior do que 5.000.000/ml, das quais 70 a

80% são leucócitos polimorfonucleares.

Quadro 9 - Interpretação da Prova California Mastitis Test – CMT ( Schalm et al., 1971)

3.6.7 Contagem eletrônica do número de células somáticas

As amostras de leite, antes do início da análise, eram mantidas em banho-maria à 38°C, durante 15 minutos, e a seguir, homogeneizadas, manualmente, sendo a contagem de células somáticas realizada por citometria de fluxo, utilizando-se o equipamento SOMACOUNT 500 da Empresa Bentley Instruments Inc..

Nesse procedimento uma alíquota de leite, depois de ser aspirada pelo equipamento SOMACOUNT 500, era misturada com o corante brometo de etídio que cora o DNA do núcleo

das células somáticas. Essas células coradas, quando expostas a uma fonte luminosa de laser, fluoresciam, sendo convertidas no tubo multiplicador do equipamento em impulsos elétricos que foram registrados e os resultados expressos em milhares de células somáticas por mililitro (número de células somáticas x 103/ml).