Kanun Gereği Mâli Hak Sahibi Olanlar

A seleção por meio de marcadores moleculares foi realizada nas gerações F4 e F5, sendo que na geração F4 foram utilizados apenas os marcadores moleculares do tipo SCAR (Tabela 2). Somente na geração F5 foram utilizados todos os marcadores. Esse procedimento foi adotado devido a dificuldades encontradas na reprodutibilidade do marcador RAPD OPX11630. Além disso, dois marcadores moleculares do tipo SCAR (SF101072 e SBA08530) já estavam disponíveis no monitoramento dos genes Ur-ON/Co- 10.

No primeiro ciclo de seleção, executado neste trabalho, cada uma das dezoito famílias F2:3 teve aproximadamente dez plantas F4 selecionadas aleatoriamente e genotipadas com marcadores moleculares. De aproximadamente 180 plantas F4 analisadas, apenas doze apresentaram todas as marcas moleculares relacionadas aos genes de interesse, representando sete das dezoito famílias F2:3 (Tabela 4). No caso dos genes que possuem duas marcas moleculares relacionadas (Co-42 e Ur-ON/Co-10/), plantas que apresentaram apenas uma marca molecular relacionada ao gene de resistência foram descartadas, como por exemplo, o genótipo 3-2-92 (Tabela 4). As doze plantas F4 com todas as marcas moleculares associadas aos genes de resistência foram selecionadas e autofecundadas para formarem famílias F4:5.

Tabela 4. Padrão de presença/ausência das marcas moleculares nas linhagens genitoras e nas progênies F4 Genótipos Marcadores Moleculares H13520 (Phg-1) F101072 (Ur-ON/Co-10) BA08530 (Ur-ON/Co-10) AB03400 (Co-5) Y20830 (Co-42) AS13950 (Co-42) AZ20845 (Co-6) Rudá-R + + + - + + + G 19-1-1-7 - - - - + + - G 1-46-7 - - - + - - - 2-4-109* + + + + + + + 2-4-110* + + + + + + + 15-2-99* + + + + + + + 15-2-100* + + + + + + + 15-3-102* + + + + + + + 29-6-52* + + + + + + + 33-2-67* + + + + + + + 427-1-21* + + + + + + + 427-3-85* + + + + + + +

A importância de avançar apenas os genótipos que apresentaram todas as marcas moleculares está no princípio de que, ao final do processo de fixação dos genes, quando as linhagens encontrarem-se em homozigose, quanto maior for o número de marcas moleculares associadas a esses genes, maiores serão as possibilidades de transferência dos alelos de resistência para outros backgrounds, utilizando-se da seleção assistida por marcadores moleculares.

Sementes F5, obtidas das plantas F4 selecionadas com marcadores moleculares, foram avaliadas visualmente quanto ao aspecto dos grãos; cinco famílias F4:5 com aspecto de grão inferior ao da cultivar Rudá foram descartadas, e as sete famílias selecionadas foram genotipadas com os marcadores SCAR relacionados aos genes de resistência. Nesta etapa de genotipagem, para cada planta F4 selecionada, aproximadamente quinze plantas F5 foram analisadas com marcadores moleculares.

Na genotipagem da geração F4:5, apenas para os marcadores SBA08560 (Ur- ON/Co-10) e SAB03400 (Co-5) foram observadas famílias segregantes. A presença de famílias segregantes na geração F4:5 referentes ao marcador SAB3400 pode ter ocorrido devido não apenas ao fato da planta F4 selecionada estar em heterozigose, como também devido a eventuais eventos de recombinação, já que o primer SAB03400a se encontra a uma distância relativamente grande em relação ao gene Co-5 (VALLEJO et al., 2001; ALZATE-MARIN et al., 2001a; ALZATE-MARIN et al., 2002b). Em relação ao marcador SBA08560a, a ocorrência de recombinantes em maior frequência do que para o marcador SF101072a, que também marca os genes Ur-ON/Co-10, já era esperada, devido à maior distância em que o marcador SBA8560a encontra-se do gene Ur-ON (CORRÊA et al., 2000).

Duas plantas F5 com marcas moleculares relacionadas a todos os genes de resistência foram escolhidas para representar cada uma das sete famílias F4:5 e constituir quatorze famílias F5:6, as quais foram analisadas em teste de progênie com o patótipo 2047 de C. lindemuthianum. A amplificação do DNA destas quatorze plantas selecionadas com o marcador RAPD OPX11 revelou a presença de uma banda de 630 pares de bases. Esta marca foi previamente reportada como ligada em acoplamento ao gene Ur-ON (FALEIRO et al., 2000b). Vale ressaltar que os marcadores OPX11630a e SF101072a flanqueiam o gene Ur-ON (FALEIRO et al., 2000b), o que reforça as garantias

de que o gene Ur-ON não foi perdido durante o processo de piramidação, mostrando que os marcadores SF101072a e SBA08560a foram eficientes no monitoramento deste gene.

distância de 12,3 cM (CORRÊA, 1999; FALEIRO et al., 2000), é razoável considerar que os marcadores SF10530a e SBA8560a também foram eficientes no monitoramento do gene Co-10.

Ao avaliar quinze plantas F6 de cada uma das quatorze plantas F5 previamente selecionadas, nove famílias mostraram-se totalmente resistentes ao patótipo 2047 de C. lindemuthianum, permitindo inferir que as plantas F5 correspondentes apresentam o alelo Co-42 fixado (Tabela 5). Outras três comportaram-se como segregantes, apresentando plantas suscetíveis e resistentes, provavelmente, em razão das plantas F5 correspondentes a estas famílias ainda encontrarem-se em heterozigose para o alelo Co- 42. As duas outras famílias apresentaram o total das plantas suscetíveis, podendo-se dizer que as plantas F5 apresentaram marcas associadas apenas ao alelo Co-4, que não confere resistência ao patótipo utilizado na inoculação.

Tabela 5. Famílias F5:6 selecionadas por apresentarem marcas moleculares relacionadas a todos os genes de resistência, além de aspecto do grão similar ao da cultivar Rudá

Família Planta F5 Reação ao patótipo

2047

Genótipo

33-2-67 49 Homozigota R Co-42/Co-42

33-2-67 50 Homozigota R Co-42/Co-42

427-1-21 11 Homozigota R Co-42/Co-42

427-1-21 60 Homozigota S Co-4/Co-4

427-3-85 31 Heterozigota Co-42/Co-4

427-3-85 33 Heterozigota Co-42/Co-4

29-6-52 28 Homozigota R Co-42/Co-42

29-6-52 25 Homozigota R Co-42/Co-42

15-2-100 26 Homozigota R Co-42/Co-42

15-2-100 42 Homozigota R Co-42/Co-42

15-3-102 39 Homozigota R Co-42/Co-42

15-3-102 43 Homozigota R Co-42/Co-42

2-4-110 57 Heterozigota Co-42/Co-4

2-4-110 59 Homozigota S Co-4/Co-4

R= Resistente, S= Suscetível

Foi necessário realizar um teste de progênie com o patótipo 2047 de C. lindemuthianum devido ao fato de o Co-42 ser um alelo do gene Co-4 presente na linhagem Rudá-R; e para que o alelo Co-42 fosse fixado nas novas linhagens piramidadas, tornou-se necessário que o gene Co-4 fosse substituído. Entretanto, como o gene Co-4 e seu alelo foram selecionados com base nos mesmos marcadores

2047 de C. lindemuthianum. Vale salientar que, dos genes monitorados no presente trabalho, somente o Co-42 é capaz de conferir resistência ao patótipo 2047.

As duas famílias que mostraram homozigose para a suscetibilidade ao patótipo 2047 foram decartadas e as plantas resistentes das famílias heterozigotas e homozigotas resistentes foram avançadas a partir dessa geração na forma de bulk dentro de família, por considerar que o material já se encontrava em alto nível de homozigose. Com isso foram obtidas doze linhagens com grãos tipo carioca em homozigose para os marcadores SH13, SF10, SBA08, SAB03, SY20, SAS13 e SAZ20 e com resistência ao patótipo 2047.