Kalite alt endeksi

O vetor pHM1 (Figura 4.2) (91) possui um gene que confere resistência ao antibiótico especti- nomicina e se replica tanto em Xanthomonas quanto em E. coli. A fim de produzir esse plasmídeo em quantidade suficiente para a realização dos ensaios posteriores, procedeu-se a uma eletropora- ção do mesmo em E. coli DH5α, conforme protocolo padrão de transformação de E. coli descrito por Sambrook (88). As células transformadas foram plaqueadas em meio de cultura LB sólido con- tendo 100µg/mL de espectinomicina. Após 16 horas, colônias isoladas foram transferidas para 3

mL de meio de cultura LB líquido, contendo 100 µg/mL de espectinomicina, e multiplicadas nas

condições ideais de crescimento de E. coli. Decorridos esse período de multiplicação celular, uma alíquota de 500 µL foi misturada a igual volume de glicerol 50% autoclavado e armazenada em tubo de 1,5 mL a −80 °C em ultracongelador. O restante foi utilizado para extração plasmidial se- guindo o protocolo descrito na seção 4.5.3. A concentração e a qualidade da preparação plasmidial

4.8 Complementação de mutantes com patogenicidade alterada 26

Figura 4.2: Esquema identificando os constituintes presente no vetor de expressão pHM1. Os sítios com asteriscos são sítios únicos presentes no vetor.

foi verificada por meio de eletroforese em gel de agarose 1%.

Em seguida, uma alíquota de 20 µL (∼2 µg) do vetor pHM1 foi clivada com a enzima de

restrição EcoR I, seguindo as orientações do fabricante da enzima (New England BioLabs), uma vez que esta enzima cliva esse vetor em um único ponto, deixando-o linearmente disposto. Após a clivagem, 5 µL da reação de clivagem foram aplicados em gel de agarose 1%. A linearização

do vetor foi verificada após a eletroforese por meio da coloração do gel com brometo de etídeo e visualização em transilumidador de luz ultravioleta.

Os fragmentos de DNA (ORF + promotor) clonados no vetor TOPO conforme descrito na seção 4.8.1 foram, isoladamente, liberadas desse vetor, por meio da clivagem com a enzima de restrição EcoR I, purificados após eletroforese do produto da reação de clivagem em gel de agarose 0,8%, e ligados ao sítio EcoR I do vetor pHM1 linearizado. As reações de ligação consistiram de: 3,5µL de

água bidestilada estéril, 1,5µL de tampão de ligase 10x, 3µL de vetor pHM1 previamente clivado

com a enzima EcoR I, 6 µL do fragmento contendo a respectiva ORF + promotor, previamente purificada, e 1µL de enzima T4 DNA ligase (1 U/µL). As reações foram mantidas por 14 horas a 14 °C.

Após o término das reações de ligação, 10 µL de cada uma foram eletroporados em 40 µL de

suspensão de células eletrocompetentes de E. coli DH10B, conforme descrito na seção 4.5.2, exceto para o antibiótico, o qual foi espectinomicina na concentração de 100µg/mL.

As colônias que cresceram foram isoladas, semeadas em meio de cultura LB líquido contendo o antibiótico espectinomicina (100µg/mL) e incubadas a 37 °C por 12 horas sob agitação constante a 200 rpm. Após a multiplicação das células, uma alíquota de 500µL de cada uma das preparações foi misturada a igual volume de glicerol 50% autoclavado e armazenada em tubo de 1,5 mL a −80 °C em ultracongelador. O restante foi utilizado para extração de DNA plasmidial seguindo o protocolo descrito na seção 4.5.3. A concentração e a qualidade da preparação de DNA plasmidial foi verificada por meio de eletroforese em gel de agarose 1%.

Para confirmar se os fragmentos estavam realmente inseridos nos vetores, foram realizadas reações de PCR, utilizando os oligonucleotídeos específicos para cada ORF em questão, conforme descrito na seção 4.8.1 com uma modificação: ao invés de utilizar o DNA cosmidial como molde, utilizou-se o DNA dos plasmídeos recombinantes.

Para cada uma das ORFs a ser complementada, foi produzido um lote de células competentes do respectivo mutante de Xac de acordo com protocolo sugerido por Yang (92) e colaboradores.

Os plasmídeos recombinantes (pHM1+ORF), que foram confirmados por PCR, foram transfor- mados em células eletrocompetentes do respectivo mutante por meio de eletroporação em equipa- mento BioRad modelo Gene Pulser II. Dez microlitros da solução plasmidial foram adicionados a 40µL de células eletrocompetentes e submetidos a um pulso elétrico de 1,8 kV sobre uma capaci-

tância de 25µF. A freqüência low range foi ajustada para 400 e a high range foi mantida no infinito. As bactérias eletroporadas foram incubadas por 1,5 horas a 28 °C e 200 RPM em 1 mL de meio SOC. Em seguida, as células foram plaqueadas em meio TSA sólido acrescido de 100 µg/mL do

antibiótico espectinomicina. Após 48 horas de incubação a 28 °C foi possível a visualização das colônias transformadas.

Cada um dos mutantes “complementados” foi multiplicado em meio de cultura TSA líquido acrescido de 100µg/mL do antibiótico espectinomicina por 24 horas, a 28 °C, sob agitação cons- tante a 200 rpm. Após o processo de multiplicação, uma alíquota de 500 µL de cada uma das

culturas foi misturada a igual volume de glicerol 50% estéril e armazenada em tubo de 1,5 mL a −80 °C em ultracongelador. O restante foi utilizado para extração de DNA plasmidial seguindo o protocolo descrito na seção 4.5.3. A concentração e a qualidade da preparação de DNA plasmidial foi verificada por meio de eletroforese em gel de agarose 1%.

4.9 Análise da expressão gênica por meio deNorthern blot reverso 28

Os plasmídeos pHM1 recombinantes de cada construção foram submetidos a reações de PCR para confirmação da inserção das ORFs. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados nessas reações foram os mesmos utilizados para as amplificações iniciais das ORFs, bem como as condições de re- ação (seção 4.8.1). Os produtos da amplificação foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1% para confirmação dos tamanhos dos fragmentos amplificados. As construções confirmadas por PCR foram submetidas a seqüenciamento automático conforme procedimentos descritos na seção 4.5.4, à excessão dos oligonucleotídeos utilizados, os quais foram substituídos pelos oligonucleotí- deos específico à respectiva ORF a ser seqüenciada.

Os mutantes “complementados” foram inoculados em folhas de limoeiro cravo conforme pro- cedimentos descritos na seção 4.3. Além do mutante “complementado”, foi inoculado o isolado selvagem de Xac, 306, o mutante e o mutante carregando somente o vetor pHM1 sem nenhum inserto.

4.9 Análise da expressão gênica por meio de Northern blot re-