Desteklemelerden faydalanma alt endeksi

Para identificar e caracterizar genes envolvidos nos processos de patogenicidade e virulência em Xanthomonas axonopodispv. citri isolado 306, construiu-se uma biblioteca com cerca de 10.000 mutantes obtidos por meio de inserção aleatória do transposon Tn5.

A fim de verificar se a inserção do transposon afetou a habilidade de Xac em causar doença, 3.300 mutantes dessa biblioteca foram inoculados em mudas de limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck). Dentre os mutantes obtidos, 122 induziram algum tipo de variação na sintomatologia.

A região onde o transposon se inseriu foi determinada para 106, dos 122 mutantes selecionados inicialmente (Tabela 5.1), pois em 16 deles não foi possível identificar a seqüência de nucleotídeos, visto que os cromatogramas se apresentaram característicos de seqüências múltiplas. A análise dos cromatogramas obtidos para estes 106 mutantes possibilitou verificar que em 98 deles o transposon se inseriu na região codificadora, em 8 a inserção ocorreu na região 5’ da ORF, provavelmente na região promotora, e em 1 mutante a inserção se deu numa região intergênica distante do início da ORF adjacente (Tabela 5.1). Além disso, 11 ORFs foram alvejadas em dois mutantes independentes, sendo que em dois deles, 17B07 e 19H08, cuja ORF mutada foi a XAC4291, a inserção ocorreu na região 5’. Em um caso, ORF XAC3265, a mutação ocorreu tanto na região 5’ (mutante 10E12) como na região codificadora da ORF (mutante 19D09). Em dois casos, uma mesma ORF foi alvejada em três mutantes diferentes: ORF XAC2047, nos mutantes 10H09, 11A04 e 11H07, e ORF XAC2072, nos mutantes 18H02, 18H11 e IIA11. Em todos os casos, os mutantes apresentaram o mesmo fenótipo, obtido por avaliações independentes e em épocas diferentes sem se ter o conhecimento prévio das seqüências alvejadas.

Com base na classificação proposta pelo TIGR (http://www.tigr.org), os genes mutados pre- sentes nas ORFs se distribuem em diversas categorias: três são classificados como pertencentes à biossíntese de aminoácidos; quatro pertencem à classe biossíntese de cofatores, grupos prostéticos

e mensageiro; três estão envolvidos com o envelope celular; quatro participam de processos celu- lares, tais como patogenicidade (xrvA) e motilidade e quimiotaxia (tsr e uptC); dois fazem parte do metabolismo intermediário central; dois fazem parte do metabolismo de DNA; oito participam do metabolismo energético; quatro fazem parte da biossíntese de ácidos graxos e de fosfolipídios; oito foram classificados como proteínas hipotéticas; dois são constituintes de elementos genéticos móveis; para catorze não existem informações suficientes para poder classificá-los; sete participam do endereçamento de proteínas, tais como o gene hrpB4 e xpsD, cuja proteína está envolvida no processo de secreção de peptídeos e proteínas, dentre outros envolvidos na síntese protéica (prmA), na degradação de proteínas, peptídeos e glicoproteínas e envolvidos no enovelamento e estabiliza- ção de proteínas; um participa da síntese protéica (prmA); seis participam de funções regulatórias (regulador transcricional, quinase serina/treonina, proteína híbrida de resposta à histidina quinase, proteína relacionada à transcrição, proteína hipotética conservada e uma histidina quinase); um co- difica uma DNA polimerase (XAC3704), relacionada ao reparo de DNA; um classificado como proteína de patogenicidade, virulência e adaptação; nove estão relacionados ao transporte de proteí- nas; oito não classificadas e uma possui função desconhecida (Tabela 5.1). Além disso, verifica-se que em três mutantes houve mutagênese em três ORFs relacionadas a produção de RNA ribossomal e uma inserção transposômica não afetou nenhuma ORF. Desse modo, verifica-se que dentre os 106 mutantes existem 91 ORFs distintas mutadas (Tabela 5.1).

Após o término do seqüenciamento e mapeamento da região de inserção do transposon, todos os 106 mutantes, previamente selecionados por apresentarem desvios quanto à sintomatologia padrão do cancro cítrico quando inoculados in planta, foram novamente multiplicados em meio de cultura e inoculados em mudas de limoeiro cravo por mais duas vezes, a fim de garantir a repetibilidade dos resultados preliminarmente obtidos. Ao final da quarta inoculação, 56 mutantes foram confirmados como defectivos para a virulência ou deficientes na elicitação da sintomatologia padrão da doença, sendo que os demais reverteram ao fenótipo selvagem.

Com base nos sintomas apresentados por cada um dos mutantes, estes foram agrupados em nove classes: ausência de encharcamento com leve hiperplasia sem necrose (ws0, hyp-, nec0); hiperplasia diminuída com necrose diminuída (hyp-, nec-); hiperplasia diminuída com necrose (hyp- , nec); ausência de hiperplasia com necrose (hyp0, nec); hiperplasia diminuída (hyp-); elicitação de necrose leve (nec-); cancro levemente branco (“light tan canker”) e ausência total de sintomas (ats) (Figura 5.2).

5.1 Análise de mutantes e teste de patogenicidade in vivo 36

Figura 5.1: “Southern blot” de 96 mutantes de Xac tomados ao acaso na biblioteca. O DNA isolado de cada mutante foi clivados com EcoR I e a membrana foi hibridizada com seqüência do transposon Tn5 marcado com o conjunto de reagentes AlkPhos Direct RPN 3680 (Amersham Biosciences), conforme seção 4.6. Mutantes com dupla inserção estão destacados por um asterisco

na elicitação da sintomatologia padrão da doença, a inserção do transposon ocorreu em 44 ORFs distintas. As ORFs XAC2047 (phaE) e XAC2072 (ugpC) foram afetadas em três mutantes distin- tos cada uma. Já as ORFs XAC4291, XAC3263, XAC0014 (cls), XAC3245, XAC3607 (uptC), XAC1201, XAC1927 (aslB) e XAC2616 (virB2) foram afetadas em dois mutantes diferentes cada uma, sendo que na ORF XAC4291 a inserção do transposon ocorreu na extremidade 5’ dessa ORF nos dois mutantes.

A análise por “Southern blot” (Figura 5.1) de 96 clones da biblioteca de mutantes, tomados ao acaso, possibilitou estimar que o número de clones de Xac com inserções duplas no genoma é de aproximadamente 6 mutantes a cada 96 mutantes constituintes da biblioteca, ou seja, apenas 6,25% dos clones apresentam inserção dupla. Nenhum dos mutantes com patogenicidade alterada confirmada possui inserções duplas, uma vez que as duas seqüências obtidas para cada mutante (a partir de cada uma das extremidades do transposon) se complementam, não deixando dúvidas tratar-se de inserção em uma única ORF específica.

Figura 5.2: Diferentes sintomas apresentados por diferentes mutantes de Xac: ausência de encharcamento com leve hiperplasia sem necrose (ws0, hyp-, nec0); hiperplasia diminuída com necrose diminuída (hyp- , nec-); hiperplasia diminuída com necrose (hyp-, nec); ausência de hiperplasia com necrose (hyp0, nec); hiperplasia diminuída (hyp-); elicitação de necrose leve (nec-); cancro levemente branco (ltc) e ausência total de sintomas (ats)

5.2 Determinação da curva de crescimento in vitro e in planta