Algumas espécies de bactérias, especialmente do gênero Bacillus, entre elas B. pumilus e B. subtilis, podem produzir esporos quando submetidas a condições
desfavoráveis para o seu crescimento e desenvolvimento. O esporo bacteriano é muito resistente ao calor, à dessecação e a outros agentes químicos e físicos. É ca- paz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida germinar, dando origem a uma nova célula vegetativa. A estrutura do esporo é constituída de uma primeira camada interna, a parede do esporo, que é composta de peptídeogli- cano; envolvendo a parede do esporo está o córtex; externamente ao córtex fica a capa do esporo que é uma estrutura rígida composta de proteína rica em ligações dissulfetos. A camada mais externa recebe o nome de exósporo e consiste em uma membrana lipoproteica com aminoaçúcares (Ribeiro & Soares, 2000).
Vários trabalhos relatados na literatura descreveram métodos de obtenção de esporos os quais foram utilizados como indicadores biológicos para esterilização por irradiação.
Pepper et al. (1956) avaliaram a resistência relativa de esporos bacterianos à radiação utilizando suspensões de diversas espécies de bactérias contendo 5 x 105
esporos viáveis por mL. Alíquotas de 0,1 mL foram transferidas para 4 discos de pa- pel de filtro que foram colocados em envelopes de polietileno, hermeticamente fe- chados e irradiados. Após serem desinfetados quimicamente, os pacotes foram imersos em meio de soja caseína para esporos aeróbios e meio de tioglicolato para esporos anaeróbios. Das 25 espécies estudadas, 24 necessitaram de 10 kGy ou mais para esterilização (Pepper et al., 1956).
Borick & Fogarty (1967) utilizaram discos de celulose de 12,7 mm de diâmetro e 1,3 cm2 de área como bioindicadores, inoculando cada um com 0,1 mL de uma suspensão de esporos contendo 107 a 108 esporos mL-1 de Bacillus pumilus, Clostri-
dium tetani, Clostridium sporogenes, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis e Baci- llus cereus. Foram estudadas condições úmidas e secas para manutenção dos bioindicadores. Discos úmidos foram lacrados hermeticamente em tiras de plástico imediatamente após a contaminação, enquanto que discos secos permaneceram por 72 horas a 37 °C e depois selados em tiras de plástico. Após irradiação com 4 níveis diferentes de dose, todos foram submetidos a testes de esterilidade. Vários experi- mentos foram planejados no estudo de Borick & Fogarty, utilizando dois diferentes materiais como suportes para os esporos: sutura de algodão (size 1 cotton sutures, Ethicon Inc.) e ágar. A sutura de algodão foi escolhida pela facilidade na inoculação
com microrganismos e na manutenção da viabilidade dos esporos. As suturas inocu- ladas com 2 x 104 esporos por sutura foram embrulhadas e seladas uma a uma em folha de alumínio de 3,5 x 7,9 cm. Dosímetros de ágar foram preparados utilizando uma suspensão de esporos de B. pumilus em ágar fundido a aproximadamente 46 °C com uma concentração de 105 esporos mL-1. Volumes de 5 mL foram pipeta- dos em placas de Petri (100 x 15 mm) da suspensão de ágar-esporos distribuídos uniformemente na superfície da placa, resultando em uma camada de ágar de apro- ximadamente 0,8 mm de espessura. As placas foram mantidas em refrigeração até que fossem irradiadas. Um dosímetro químico foi colocado com cada dosímetro de ágar para determinação da dose inicial e final. As contagens foram feitas após der- ramar ágar nutriente (PCA) sobre as suspensões de esporos em ágar irradiado e incubar a 37 °C. Os autores observaram que alguns materiais podem proteger o mi- crorganismo porque a esterilização foi mais difícil nos dosímetros de ágar do que nas suturas (Borick & Fogarty, 1967).
Parisi & Antoine (1975) prepararam esporos de B. pumilus inoculando a su- perfície de placas de TSA com 1 mL de uma cultura de 24 horas em meio de TSB. As placas inoculadas foram incubadas até que a esporulação excedeu 95%, o que normalmente acontece em menos de 7 dias. Os esporos foram recolhidos lavando- se a superfície do ágar com água estéril e deionizada, seguida de mais três lava- gens por centrifugação. Os indicadores biológicos foram preparados inoculando-se tiras feitas de suturas de algodão (size 1 Sutupak Cotton, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.) com uma suspensão de esporos em álcool isopropílico:água (80:20) para dar uma concentração de 2 x 104 esporos em cada bioindicador. Após a inoculação e secagem ao ar, as tiras foram lacradas por calor. A avaliação quanto ao efeito da radiação por exposição a uma fonte de 60Co foi feita por teste de esterilidade. Os pesquisadores também estudaram gradiente de concentração de esporos em indi- cadores biológicos de papel Whatman n.1 inoculados com 0,1 mL de quantidades variadas de B. pumilus em álcool isopropílico:água (80:20) para dar concentrações finais de 105, 106, 107, 108 e 109 esporos. As amostras expostas a diferentes doses de radiação foram testadas quanto à esterilidade e cepas danificadas foram avalia- das quanto à motilidade e formação de película. Devido à pequena porcentagem de culturas que apresentaram algum dano após irradiação, os autores afirmaram que uma espécie microbiana tem valor como indicador biológico quando pode ser detec-
tada, de forma confiável, após um tratamento ineficaz de esterilização (Parisi & An- toine, 1975).
Prince (1976) estudou a viabilidade e a radiorresistência dos esporos de B. pumilus pelo cultivo em placa de TSA por 10 dias a 35 °C, tempo em que houve no mínimo, 90% de esporulação. A cultura foi removida com um bastão de vidro e a massa celular foi lavada três vezes por centrifugação com água estéril e deionizada. A pasta densa foi levada a choque térmico por 15 minutos a 80 °C para eliminar as formas vegetativas, sendo rapidamente resfriada e então congelada até o momento do uso. Contagens de esporos viáveis de suspensões congeladas permaneceram inalteradas após quatro anos a -10 °C (com densidade celular de aproximadamente 1010 esporos mL-1). Os carregadores foram preparados diluindo-se a pasta com iso- propanol 80% (m/v) e assim as tiras de papel de filtro (40 mm x 8 mm) foram inocu- ladas com 0,1 mL, seguida da secagem em temperatura ambiente por cinco dias em um dessecador a vácuo com CaCl2. A recuperação dos esporos foi realizada pela
trituração das tiras amolecidas em um almofariz com pistilo, seguida da diluição e contagem de placas de TSA incubadas a 35 °C por 48 horas em duplicata. O valor encontrado de D10 de esporos de B. pumilus foi de 0,17 a 0,18 MRad (1,7 a 1,8 kGy)
após 1 ano a 5 ou 25 °C (Prince, 1976).