No milho, o Opaco2 (O2) atua regulando a expressão de certos membros da família de genes que codificam para as proteínas de reserva zeína (prolamina) na semente.
A seqüência codificante (seis exons) de O2 (HARTING et al., 1989; SCHMIDT et al., 1990) é interrompida por cinco íntrons é precedida por uma seqüência leader muito longa contendo três ATGs upstream ao ATG de início da transcrição. A seqüência de aminoácidos deduzida a partir do cDNA revelou uma proteína de 437 aminoácidos com forte homologia com a família de fatores de transcrição, presentes em fungos e mamíferos, com domínio de união ao DNA do tipo “basic leucine zipper” (bZIP-zíper básico de leucina) (LANDSCHULZ et al., 1988). Dito domínio é bipartido, consiste de repetições periódicas de LEU cada sete aminoácidos (o zíper) que constituem a interface de dimerização (SASSONE-CORSI et al., 1988; KOUZARIDES; ZIFF, 1988; SCHUERMANN et al., 1989). O exon-5 contém o domínio de dimerização (MADDALONI et al., 1989) e o exon-4 o motivo básico, responsável pelo reconhecimento específico da seqüência de DNA alvo (TURNER;
TJIAN, 1989; NEUBERG et al., 1989) onde foi observado a presença invariável de um resíduo ASN e outro de ARG.
Em O2, o motivo de dimerização está representado pela seqüência L1-L2-L3-L4-A-L5-
L6, uma simples ALA interrompe a repetição de sete LEU e os traços representam seis
aminoácidos. Foi observado entre diferentes bZIP que aminoácidos neutros ou hidrofóbicos podem às vezes substituir LEU, sendo portanto possível que a ALA nesta posição seja parte de um motivo de dimerização altamente conservado no milho.
Foi determinado que durante o desenvolvimento do endosperma as quantidades de O2 permanecem constantes embora as quantidades de O2 mRNA incrementa dramaticamente entre 15-30DAP (SCHMIDT, 1993).
A mutação o2 resulta na redução da expressão de genes que codificam para polipeptídios da fração zeína, sendo a classe zeína 22kDa a mais severamente afetada (MULLER et al., 1995) e em menor extensão a zeína de 19kDa (SOAVE; SALAMINI, 1984; MOTTO et al., 1989).
Consistente com estes efeitos fenotípicos, somente os genes zeína 22kDa e 19kDa contém sítios de união para O2 nos promotores (SCHMIDT et al., 1992; CORD-NETO et al., 1995; VICENTE-CARBAJOSA et al., 1997).
A proteína O2 reconhece uma seqüência palindrômica imperfeita 5'-TCCACGTAGA- 3', denominada caixa opaco2 (O2-box), presente na região promotora de genes zeína- 22kDa. Esta seqüência esta inserida dentro da caixa prolamina (prolamin box) existindo três sítios de união para O2 denominados Z1, Z2 e Z3, em associação com outra seqüência reguladora -300, o motivo endosperma (endosperm motif), seqüência que da especificidade para expressão do gene no endosperma. Próximo ao extremo 3' da caixa prolamina foi observada uma seqüência muito similar ao sítio de união do fator GCN4 (MAURI et al., 1993).
Um segundo tipo de fator de transcrição b-ZIP em milho, chamado OHP1 (O2- heterodimerizing protein1), foi também observado a unir-se a O2-box, tanto na forma de um homodímero como em complexo heterodímerico associado a O2 (PYSH et al., 1999).
A proteína PBF (prolamin box-binding factor) pertence a classe de proteínas Cys2-
Cys2 zinc-finger, em plantas foi observada a unir-se especificamente a promotores da
família de genes zeína-22kDa e in vitro a interagir com O2. Este fator trans específico do endosperma, se une com elevada afinidade ao motivo endosperma, numa seqüência de 7pb altamente conservada (5'-TGTAAAG-3'), observada nos promotores dos genes para
proteínas de reserva na semente da maioria dos cereais (VICENTE-CARBAJOSA et al., 1997).
A síntese de polipeptídios da fração zeína nas células do endosperma se inicia aproximadamente 10-12DAP e alcançam um platô em 35-40DAP. De modo similar, os transcritos O2 aparecem 11DAP e permanecem constantes por aproximadamente 25 dias (GALLUSCI et al., 1994). A participação de várias proteínas na regulação da expressão dos genes da zeína poderia estar sendo controlada por mecanismos que operam pós- transducionalmente e em resposta a diferentes condições fisiológicas e ambientais.
Ciceri et al. (1997), demonstraram que O2 é fosforilado e as várias isoformas correspondem a diferentes graus de fosforilação do polipeptídeo. Apenas as formas hipofosforiladas e não fosforiladas de O2 podem-se unir com elevada afinidade as seqüências O2-box. Portanto, O2 se apresentaria formando um pool de polipeptídeos com diferente graus de fosforilação e a união a seqüência O2-box seria modulada por um mecanismo de fosforilação/desfosforilação influenciado pelas variações nas condições ambientais.
Ciceri et al. (1999), demonstrou que os transcritos de O2 e PBF compreendem oscilações pronunciadas durante o ciclo dia-noite. Ao meio dia apresentaram os níveis mais elevados dos mensageiros e a meia noite os níveis mais baixos. Entretanto, o transcrito OHP1 permanece constante durante o ciclo dia-noite. Contudo, a semente não está diretamente envolvida na percepção da luz, mas responderia a fluxos de nutrientes para o endosperma durante o dia. Ainda, O2 não regula sua própria transcrição de modo que as variações nos níveis dos transcritos e o padrão de fosforilação da proteína estariam controlados por um ritmo circadiano. Foi proposto que a atividade de O2 regulando genes durante o desenvolvimento do endosperma poderia ser sensível a sinais luminosos que seriam captados em outras partes da planta e então transmitidos às sementes durante o desenvolvimento.
Análises da seqüência de aminoácidos de O2 revelaram a presença de seqüências alvo para três quinases de serina-treonina: proteína quinase C, proteína quinase A e caseína quinase II (CKII). A adição dos grupos fosfatos ao polipeptídeo O2, foi proposta a ser realizada pela proteína CKII (CICERI et al., 1997) devido a sua localização citoplasmática e nuclear em plantas (ZHANG et al., 1993), sua presença em endosperma de milho (GRASSER et al., 1989), e sua participação modulando a atividade dos fatores de transcrição em plantas (KLIMCZAK et al., 1995). Na proteína O2 a seqüência consenso
para união de CKII (KREBS et al., 1988) foi observada em oitos locais, seis dos quais poderiam ter relevância biológica por estar enquadrados no domínio N-terminal relacionada à sua atividade como fator trans e próximos ao sinal de localização nuclear (NLS-B) (CICERI et al., 1997).
As proteínas de b32 e zeína 22kDa aparecem grandemente diminuídas em o2. Recentemente a traves de estudos de expressão transitória (LOHMER et al., 1991) foi sugerido que o promotor b32 poderia ser especificamente ativado pela proteína O2.
Foi sugerido um papel para b32 na defesa contra patógenos como conseqüência da alta susceptibilidade ao ataque de fungos (LOESCH et al., 1975) e de insetos (GUPTA et al., 1970) nos grão de o2.
Bass et al. (1992), determinaram que a proteína b32 é um membro de uma classe grande e amplamente distribuídas de proteínas tóxicas de plantas que inativam ribossomos (RIPs). As RIPs são RNA N-glicosidases que removem uma simples base de um loop altamente conservado no 28S rRNA requerido para a união do fator de elongação 1α (EF- 1α). Ensaios in vitro mostraram que os ribossomos de milho e trigo foram resistentes a b32 de milho, mas foram inibidos pela RIPgelonina de dicotiledôneas. Os autores observaram também atividade de RIP durante o desenvolvimento da semente e na germinação.
Não é bem conhecido a função biológica das RIPs, mas elas apresentam características de agentes de defesa constitutivos, acumulam em níveis elevados na semente e não tem efeito aparente sobre processos endógenos. Bass et al. (1992), sugere que no milho a síntese coordenada das RIPs e da zeína baixo o controle do O2 suprem as plântulas em crescimento de nutrientes e dão proteção contra a invasão de patógenos ao endosperma.
Gallusci et al. (1996), mostraram que o fator O2 regula também a expressão da enzima citoplasmática ortofosfato diquinase (cyPPDK) no endosperma de milho. O padrão de expressão do gene para enzima cyPPDK foi similar ao observado para o gene lor-sdh. A cyPPDK esta localizada principalmente nas células do endosperma em contato com a aleurona e em menor quantidade nas células do endosperma central. Dita localização é também a região de expressão ativa de genes da zeína e de O2 (VARAGONA et al., 1991; DOLFINI et al., 1992). Esta observação se correlaciona com a hipótese de controle transcricional do gene lor-sdh pelo fator O2 e reforça a idéia de um controle geral do metabolismo de aminoácidos e síntese de proteínas pelo O2.
Maddaloni et al. (1996), demonstrou que a proteína O2 pode ativar a expressão do gene repórter CAT (cloranfenicol acetil transferase) sob o controle do promotor cyPPDK1. A seqüência de união de O2 no promotor cyPPDK1 mostrou elevada homologia com o sítio de união de O2 no promotor do gene b32 (LHOMER et al., 1991).
Em vista da informação armazenada, parece possível sugerir que O2 atuaria de modo a coordenar a expressão não apenas de certos genes da família α-zeína e b32 ou mesmo b70 associado ao acúmulo ordenado de polipeptídios da fração zeína nos corpúsculos protéicos (MOROCCO et al., 1991), mas também coordenando genes envolvidos na distribuição do carbono entre proteínas e amido. A enzima cyPPDK atuaria como fornecedor de fosfoenolpiruvato (PEP) para a conversão em aminoácidos durante o desenvolvimento da semente, de modo a manter a síntese de proteínas de reservas. O PEP é chave na interface entre o metabolismo do carbono e nitrogênio, e o composto comum nas vias de síntese dos aminoácidos aromáticos. Além disso, o PEP pode ser usado pela PEP-carboxilase para recapturar CO2 durante o processo da respiração, gerando então oxalacetato, que em princípio pode sofrer transaminação para formar aspartato (ASP).
O papel específico de o2 regulando a expressão de genes da fração zeína foi demonstrado por Kodrzycki et al. (1989). Claramente foi observado que o2 afeta o inicio da transcrição da família de genes zeína-22kDA. Estes dados e a constatação de que O2 contem um domínio bZIP de união a DNA (HARTING et al., 1989; SCHMIDTH et al., 1990) sugerem que O2 regula a expressão da zeína pela interação direta com promotores de genes zeína.
Evidencia direta foi obtida por Schmidth et al. (1990), trabalhando com um peptídeo de O2, fragmento contendo apenas o motivo b-ZIP, observou que dito fragmento foi suficiente para unir-se a região promotora do gene zeína-22kDa. Entretanto, experimentos in vitro não observaram a união de O2 a fragmentos promotores dos genes da classe zeína-19kDa.
Outra prova consistente desta interação foi demonstrado que o defeito em um mutante o2-676 no domínio de união ao DNA, o códon para ARG do domínio básico foi mutado para uma LYS (AUKERMAN et al., 1991) impede a O2 reconhecer o sítio alvo de DNA. Existem apenas dois aminoácidos invariáveis em todas as proteínas desta classe; uma é a ARG e o outro uma ASN localizada também no domínio básico. A ASN foi hipotetizado prover flexibilidade a estrutura α-hélice do domínio básico o que permite a α-
hélice encaixar na cavidade maior de DNA no sitio alvo (VINSON et al., 1989). De fato, para O2, a união ao DNA foi impedida quando substituída a ASN seja com ASP ou GLN (AUKERMAN et al., 1991).