4. BULGULAR VE TARTIŞMA
4.9. Köklendirme Çalışmalarıyla İlgili Genel Değerlendirme ve Tartışma
aşaması da büyük önem arz etmektedir. Köklenme mikroçoğaltım başarısının belirlenebilmesi için en önemli adımıdır. Bu adım sadece sürgünlerin köklenmesini içermez aynı zamanda bitkinin doğal ortamda hayatta kalabilme potansiyelinide belirler. Otsu bitkilerde adventif kök oluşumu kolayca uyarılabilir fakat odunsu bitkilerde bu uyarım daha zordur (Bajaj 1991). Elde edilen bitkinin arazi şartlarına aktarımı ve sağlıklı bir şekilde yaşayabilmesi için sağlıklı köklenmenin ve köklenme oranın yüksek olması gerekmektedir. İn vitro bitki doku kültüründe yarı katı besi ortamlarında mikroçoğaltılmış fıstıkların köklenmeye verdikleri cevaplar farklı olmuştur (Tilkat ve ark. 2008; Benmahioul 2009; Tilkat ve Onay 2009; Akdemir ve ark. 2014).
Doku kültürü çalışmalarında kök oluşumu için oksinler kullanılmaktadır. Köklendirici madde olarak kullanılan oksinler olarak; IAA, NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T ve picloram sayılabilmektedir (Babaoğlu ve ark. 2002). İn vitro çoğaltılmış bitkilerin köklenmesine; kültürü başlatılan bitkinin başlangıç eksplantın tipi (tohum, apikal meristem, nodal tomurcuk vs.), kullanılan oksin çeşidi ve konsantrasyonu, sürgün uzunluğu, karanlık uygulamaları, kullanılan şeker çeşidi gibi faktörlerden etkilenmektedir. Çalışmamızda kullanılan materyalimiz kontrollü tozlaşma ile elde edilen melez tohumlar olmuştur. Melez bitkilerle çalışmanın zorlu yanlarından biri köklenmenin istenilen düzeyde gerçekleştirilmemesidir. Fakat denediğimiz parametler ile melez klonal hatların köklenmesinin beklenilen oranın üzerinde olduğu görülmüştür.
İn vitro köklenme için, yarı katı besi ortamında çoğaltımış antepfıstıklarının köklenmeye verdikleri cevaplar farklı olmuştur (Tilkat ve ark. 2008; Benmahioul 2009; Tilkat ve Onay 2009). Akdemir ve ark. (2014) daha düşük bir köklenme başarısı elde etmişlerdir. İn vitro kültürde çoğaltılmış mikrosürgünler 2 mgl-1IBA içeren biyoreaktör sisteminde (RITA) ortalama 3.72 kök oluşumu ile %27.5 kökleme elde etmişlerdir. Bununla birlikte daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda %20 (1 mgl-1 IBA) ve %27.5 (4 mgl-1 IBA) köklenme yüzdesi elde etmişlerdir.
Barghchi ve Alderson (1983), antepfıstığında in vitro köklendirme için en uygun oksin çeşitinin IBA olduğunu rapor etmişlerdir.
152
Bustamante-Garcia (1984), eksplantların köklenmesini sıvı ya da katı NAA ve IBA kullanılarak artırıldığını kaydetmişlerdir.
Pontikis (1984), eksplantların olgun P. terenbinthus olgun ağaçlarından alınan eksplantlarda köklenmenin %60 olduğunu ve köklenmeye alınacak sürgün uçlarının 10 sn 100 mgl-1 IBA’ya daldırıldığında köklenmenin %50 olduğunu bildirmiştir.
Barghchi ve Alderson (1985), yaptıkları çalışmada iki yaşındaki P. vera’dan aldıkları eksplantlardan sürgünlerin köklendirilmesinde üzerine denedikleri IBA’nın 2.5, 3.0 ya da 3.5 mgl-1 oranlarında kullanılmasında bu oranların köklenme üzerine önemli bir farklılık olmadığını ve denenen bu ortamlarda köklenmenin yaklaşık olarak %80 olduğunu bildirmişlerdir.
Martinelli (1988), tarafından yapılmış olan çalışmada 4 dört yaşındaki P. vera ağacından alınan eksplantların ön işlem olmadan köklenme oranının %30 – 40 olduğunu fakat ön işlem olarak 10 sn IBA çözeltisine daldırılğında köklenme oranın %50 olduğunu bildirmiştir.
Abousalim (1990), tarafından antepfıstığının optimum köklenmesi üzerine köklenme öncesi köklenme için kullanılan IBA konsantrasyonlarının yaklaşık 1 mgl-1 ve 2 mgl-1 oranlarında alt kültüre alınmış eksplantlarda daha iyi sonuç verdiğini rapor etmişlerdir.
En yüksek köklenme Parfitt ve Almehdi (1994) tarafından P. vera ‘Kerman’ çeşidinde genç materyaller (fideler) kullanıldığında %88 olarak rapor edilmiştir.
Parfitt ve Almehdi (1994), P. vera ile yaptıkları köklenme çalışmalarında 2.5 mgl-1 IBA kullanımında %88 köklenme elde edildiği rapor edilmiştir.
Dolcet-Sanjuan ve Claveria (1995), P. vera Mateur ile MS besi ortamında oksin konsantrasyonlarının değerlendirildiği çalışmada bir hafta sonra beyaz kallus oluşumunu gözlemlemişlerdir. Daha önceden rapor edilenlerin aksine (Barghchi ve Alderson 1989; Martinelli 1988; Mederos ve Carreño 1991; Parfitt ve Almehdi 1994), IBA’nın kök oluşumu uyarımında en iyi oksin olmadığını, NAA’in IBA ve IAA’ya göre kök uyarımında daha fazla etkiye sahip olduğunu bildirmişlerdir.
Onay (2000), P. vera L.’nin olgun ağaçlarından alınan nodal segmentlerden başlatılmış in vitro kültürden elde edilen mikrosürgünlerin köklenmesi 4.9, 9.8 ve 19.6
153
μM IBA ile desteklenmiş MS besi ortamında bütün ortamlar için %80 köklenme başarısı elde edilmiştir.
Tilkat ve ark. (2005), in vitro çimlenmiş tohumlardan başlatılan P. khinjuk Stocks sürgünleri için, en etkili köklenme ortamı olarak 0.5 mgl-1 IBA ile desteklenmiş MS besi olduğu rapor edilmiştir. Maksimum kök uzunluğunu 0.5 mgl-1 IBA ile destekli MS besi ortamından 2.98 ± 0.37 olarak bildirilmiştir.
Tilkat ve ark. (2008), erkek antepfıstıklarının hızlı bir şekilde proliferasyonu ve köklenmesi üzerine yaptıkları çalışmada, her birinden 2 mgl-1 olmak üzere IBA, NAA ve IAA ile IBA’nın farklı konsantrasyonlarınının (0.5, 1, 2, 4, ve 8 mgl-1) etkisini ve ayrıca eksplant boyunun (1, 2, 3 ve 4 cm) köklenmeye etkisi değerlendirilmiştir. Kök oluşumuna en etkili oksinin IBA olduğu, en yüksek köklenme oranını (%78) veren mikrosürgün uzunluğunun ise 4 cm olduğu 4 haftalık kültür sonucunda kaydedilmiştir.
Tilkat ve ark. (2009), 25 yaşındaki P.vera L. “Atlı” olgun ağaçlarından alınan apikal sürgünlerden alınarak başlatılan in vitro kültürlerde sürgünlerin köklenmesi üzerine yaptıkları çalışmada iki veya üç yaprak içeren 3 cm’den büyük mikrosürgünler 30 g L-1 sukroz, 5.5 g L-1 agar ve 9.84 μM IBA içeren tam karı MS besi ortamında köklenmeye alındılar. Köklenme çalışmaları şu şekilde devam etti. Köklenmeden önce yıkama: mikrosürgünlerin bazal uçları keskin ve steril bir bisturi yardımıyla kesildi ve 100 rpm’de 1 – 2 saat çalkalanarak durulandı. Daha sonra yıkanmamış bir kontrol grubu ile birlikte köklenme ortamına alındılar. Köklenmeden önce yıkama ve daldırma: tek bir sürgün ucundan klonlanmış mikrosürgünler steril su içeren bir Erlenmayer içinde sallayarak yıkandılar. Daha sonra kesim uçları 1, 5 ve 10 d %70’lik etil alkol ie hazırlanmış (4.92, 24.6, 49.2 μM ve bir kontrol grubu ile) IBA solüsyonuna daldırılmıştır. Daha sonra sürgünler köklenme ortamına alınmıştır. Yapılan kapsamlı köklenem çalışmaları sonucunda en yüksek köklenme oranının %92 ile 4 cm uzunluğunda sürügünlerin iki defa yıkanarak kullanılması ile yaklaşık 14 günde elde edildiği rapor edilmiştir.
Benmahioul (2009), antepfıstğının köklenmesi üzerine 0.25 mgl-1 BSAA (3- Benzo(b)selenyl Acetic Acid): %10, 0.5 mgl-1 BSAA %20 ve 1 BSAA mgl-1 : % 6.7 BSAA kullanımın çok iyi sonuçlar vermediğini bildirmişlerdir.
154
Delijam ve ark. (2016), P. vera’nın mikroçoğalrımı üzerine yaptıkları kapsamlı çalışmada oksinlern köklenmeye olan etkisi de araştırılmıştır. Çeşitli oksinler içeren GNH (Garoosi, Nezami ve Haddad) besi ortamında en iyi gelişen sürgün uçları (1 – 2 cm uzunluğunda) aktarılmış. Sürgünler oksin içeren GNH besi ortamında bir hafta sonra kallus oluşumu gözlendiktan sonra sürgünleri oksin içermeyen taze GNH besi ortamına aktarmıştır. İki hafta sonra kök uzamasının başladığı görülmüştür. Sonuçlar göstermiştir ki bir haftalık ilk bekleme döneminde NAA’in IBA’dan daha fazla kök oluşumunu uyardığı rapor edilmiştir. Yaptıkları ikinci bir köklenme deneyinde 2 mgl-1 NAA içeren GNH besi ortamına farklı Ca ve Fe kaynaklarının köklenemeye olan etkisi araştırılmıştır. Sonuçlar göstermiştir ki Ca ve Fe kullanımının; köklenme yüzdesini, kök oluşturan ortalama sürgün sayısını, kök uzunluğunu içeren köklenme paremetrelerini önemli derecede etkilediğini bildirmişlerdir. Ca glukonat kullanımında köklenme yüzdesinin yaklaşık %50 olduğu, Fe kaynağı kullanımında ise yaklaşık %72 köklenme yüzdesi elde ettiklerini rapor etmişlerdir.
Marin ve ark. (2016), antepfıstığının köklenmesi üzerine paclobutrazolun uygun etkisini göstermek için yaptıkları çalışmada bu inhibitörün GA sentezini iyileştirdiği ve köklenmede %83.3’e ulaşıldığı bildirildi.
Son yıllarda mikroçoğaltılmış sürgünlerin köklenmesi üzerine büyük ilerlemeler sağlandı. Aslında dış ortamdaki köklenme için; sürgünlerin bazal uçları dikimden önce ticari köklenme tozlarına (%2 IBA) batırılır. Mikrosürgünler turba : perlit : vermikülit (80 : 15 : 5) karışımı içeren kaplara yerleştirildi bu kaplar kapalı plastik tepsilere alınıp daha sonra yüksek nispi nem koşulları altında muhafaza edildi. Bu yöntem ile köklenme yüzdesi bakımından en iyi sonuç %82 olarak, mikrobitki başına düşen kök sayısı da 3 – 4 kök arasında değiştiği rapor edildi (Benmahioul 2017).
Benmahioul (2017), in vitro çoğaltılmış antepfıstığı sürgünlerinin köklenmesi üzerine çalışmalarını iki basamakta yürütmüştür. Köklenme için seçilen sürgünler farklı oksinlerin 0.5 – 2.5 mgl-1 arasında (IBA ve NAA) tek olarak ya da kombinasyonlarını içeren konsantrasyonlarda yarı katı MS besi ortamında kültüre almıştır. Kültürün birinci haftasının sonunda sürgünler, kök uzaması için aynı besi ortamının hormon içermeyenine aktarılmışlardır. En iyi sonucu 1 mgl-1 NAA : %35, 1 mgl-1 IBA/ANA (1/1) %24 köklenme ve 2.5 mgl-1 IBA : %23.3 köklenme elde etmiştir.
155
Yaptığımız köklenme çalışmalarında, köklenecek sürgünün ve köklenme ortamında kullanılan oksinin türü ve konsantrasyonu üzerinde duruldu. Çalışma sonuçlarına göre ise; oksin çeşidi ve konsantrasyonundan ziyade sürgün uzunluğunun köklenmeye çok fazla etki ettiğini ve köklenme oranı bakımından değerlendirildiğinde her üç genotip için 3 cm uzunluğundaki sürgünlerin en iyi sonuç verdiği tespit edilmiştir.