Os principais métodos analíticos utilizados nos experimentos realizados foram os seguintes:
4.3.1 Análise de densidade e viabilidade celular
Para a análise de viabilidade e densidade de células foi utilizado o método de exclusão do corante azul de tripan em hemacitômetro (DOYLE & GRIFFITHS, 1998). Foram contados 16 quadrantes (8 quadrantes/câmara) com cerca de 50-100 células em cada um, para diminuir os erros de contagem. A média e o desvio padrão das medidas de densidade e viabilidade celular foram determinados considerando 4 eventos de contagem, sendo cada evento representado pela contagem de 4 quadrantes.
Na análise de densidade celular foram retiradas alíquotas de 90 µL do recipiente em questão, em seguida foram acrescentados 10µL de uma solução etílica 0,04% azul de Tripan (Trypan Blue, Sigma T-6146) preparado anteriormente. Quando necessário, a amostra foi diluída em tampão PBS (Gibco, NY) de forma a se obterem em torno de 100 a 120 células por quadrante. Com ajuda de uma micropipeta inseriu-se uma alíquota de 10µL da amostra corada numa câmara de Neubauer, previamente preparada antes de acrescentar o corante na amostra, pois a viabilidade é afetada na presença prolongada no corante. A contagem foi realizada em microscópio OLYMPUS CK30, utilizando a objetiva de 10x.
As células que se apresentam não coradas são classificadas como células viáveis. Já as células que se apresentam coradas são classificadas como células não viáveis.
A densidade celular total é dada pelo somatório do número de células não coradas (viáveis) mais o número de células coradas (não viáveis), multiplicado pelo fator de diluição e pelo volume de um quadrante da câmera de Neubauer, como mostra a equação 4.1.
(
+)
× × = × −1 mL ais Célulastot c d V n FD V X n (4.1) A densidade de células viáveis é dada pelo número de células viáveis, multiplicado pelo fator de diluição e pelo volume de um quadrante da câmara de Neubauer, de acordo com a equação 4.2. × × = × −1 mL viavéis Células c V FD V X n (4.2)Já a viabilidade celular é dada pela razão entre o número de células viáveis e o número de células total no meio (células viáveis e inviáveis), multiplicados por 100, como mostrado na equação 4.3. Célulasviáveis d V V n n n % 100= × + (4.3)
onde nV é o número total de células viáveis, nd é o número total de células inviáveis, X é a
densidade celular, Vc é o volume de um quadrante da câmara de Neubauer e FD é o fator de diluição para células de inseto. O volume de um quadrante da câmara de contagem é de 10-4 mL.
4.3.2 Análise de morte celular
Para a análise de morte celular foi utilizado o método da quantificação da enzima lactato desidrogenase (LDH) liberada para o meio de cultura, utilizando para tal o kit enzimático Tox-7 (Sigma Aldrich Co.). O método da lactato desidrogenase é um meio de
medir o número de células tanto pela lactato desidrogenase citoplasmática total (LDH) quanto pela integridade da membrana, como uma função da quantidade de LDH citoplasmática liberado no meio. A quantidade de células mortas pode ser quantificada pela quantidade de LDH liberada no sobrenadante. O método da lactato desidrogenase é simples, exato e com resultados reprodutíveis (LEGRAND et al., 1992). O método é baseado na redução do NAD+ pelo LDH a NADH. O NADH então é utilizado na conversão estequiométrica do corante tetrazólio formando um derivado de formazan vermelho. O composto colorido resultante é medido por espectrofotometria. Se alíquotas do meio de cultura sem células são medidas, então a quantidade de LDH pode ser usada como um indicador da quantidade de células mortas, ou seja, da viabilidade real do cultivo.
Primeiramente retirou-se uma alíquota do meio de cultivo, centrifugou-se a 1000 rpm por aproximadamente 3 minutos, separando o sobrenadante do pellet. Retirou-se uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante e acrescentou-se 0,25 mL de solução do kit previamente preparada para que se iniciasse a reação. A amostra permaneceu em temperatura ambiente e coberta por papel alumínio para proteger da luz. Após 25 minutos, adicionou-se 75µL de solução de ácido clorídrico (HCl) 1 M para interromper a reação e então mediu-se a absorbância pelo espectrofotômetro ULTROSPEC 2100 pro (UV/Visible espectrophotometer) em múltiplos comprimentos de onda, a 490 nm e 690 nm, onde a absorbância utilizada foi a diferença entre as absorbâncias obtidas nesses dois comprimentos de onda, conforme recomendado pelo fabricante do kit para análise de LDH utilizado. A densidade de células mortas foi calculada a partir da relação entre a absorbância e a densidade celular determinada através de uma curva padrão de várias densidades celulares lisadas com 1% v/v de Triton. Esta relação foi aproximadamente constante em todos os experimentos variando de acordo com a expressão, abaixo:
XLDH =2,36×106×Abs (4.4)
onde: XLDH = densidade de células mortas determinada por LDH, cel.mL-1
Abs = valor da absorbância medida da amostra.
4.3.3 Análise de substratos e metabólitos
Para análise de carboidratos utilizou-se cromatografia líquida de alta performance (HPLC), com coluna de resina Aminex HPX-87H (Bio-rad), fase móvel H2SO4 5mM,
temperatura de 65°C e fluxo de 0,6 mL.min-1 em cromatrógrafo Waters com detecção através do índice de refração (W410, Waters) para carboidratos e UV 210nm para ácido láctico. A concentração de aminoácidos foi determinada também em HPLC, pelo sistema Pico-tag utilizando coluna de fase reversa (Waters), detecção por UV 254 nm, de acordo com Cohen et al. (1989). A análise da concentração de amônio foi feita através de um eletrodo seletivo, modelo ORION 710A (Thermo cientific) .
4.3.4 Análise de produto
A análise da glicoproteína da raiva (GPV) foi realizada no Instituto Butantan, em São Paulo, pelo método ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizando antígenos e anticorpos específicos para esta análise. Na a análise de GPV, retirou-se o pellet de células do ultrafreezer e aguardou-se por aproximadamente 5 minutos ou até que descongelasse. Ressuspendeu-o com 0,5 mL de Tampão A (4ºC) (25 mM de Tris (pH 7,4), 25 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2 e H2O), agitou-se em vórtex até a desagregação total do aglomerado.
Nonidet P-40) e agitou-se novamente em vórtex. Incubou-se a amostra na geladeira ou em banho de gelo durante uma hora. Neste período submeteu-se a amostra ao vórtex (cerca de 10 segundos) a cada 15 minutos. Ao final da incubação, centrifugou-se a amostra a 10000 rpm (10625g) durante 10 minutos para remoção de debris celulares. Utilizou-se apenas o sobrenadante na análise de ELISA, o método pelo qual tem como princípio a imunocaptura. A placa de poços utilizada no ensaio é sensibilizada com anticorpo policlonal purificado anti- glicoproteína da raiva. A glicoproteína da raiva, uma vez presente na amostra se liga a estes anticorpos, os quais são subseqüentemente ligados com anti-glicoproteína da raiva marcada com peroxidase, enzima que é capaz de catalisar a produção de um composto colorido quantificável por espectrofotometria. A comparação da absorbância medida para a amostra testada com a absorbância das diluições do antígeno de referência permite a determinação da concentração da glicoproteína na amostra, como descrito por Astray et al. (2008).