IFN , IL4, IL12(p40), IL1, IL8 SİTOKİN ve sIL2R SİTOKİN

3.6.1.1 Kullanılan Solüsyonlar ve Standartlar

Reagent Set B

İçerisinde farklı amaçlarla kullanılan beş farklı solüsyon bulunmaktadır. Bunlar; 1. Çalışma solüsyonu:

a. ELISA plaklarının bloklanmasında,

b. Standardların seri sulandırımlarının hazırlanmasında,

c. Hastalara ve kontrol grubu bireylerine ait özgün in vitro proliferasyon kültürlerinden elde edilen üst sıvılar ile serum sulandırımlarının hazırlanmasında, d. “Anti-insan sitokin/sitokin reseptörü mAb’ları + Streptoavidin-HRP” hazırlanmasında

e. Anti-insan sitokin mAb’u (Yakalayıcı antikor), biotinle işaretli anti-insan sitokin mAb’u (Saptayıcı antikor) ve Streptavidin-horseradish peroksidaz konjüge sulandırımlarının hazırlanmasında kullanıldı.

2. Plak kaplama solüsyonu:

ELISA plaklarının anti-insan sitokin/sitokin reseptörü mAb’u ile kaplanmasında kullanıldı.

3. Stok yıkama solüsyonu:

Yirmi kat konsantre stok yıkama solüsyonu, kullanımdan önce 1/20 oranında sulandırılarak, yıkama basamaklarında kullanıldı.

4. Substrat miyarı A ve B:

Kullanımdan 15 dakika önce, eşit hacimde karıştırılarak substrat solüsyonu haline getirildi.

5. Reaksiyon durdurucu solüsyon:

Reaksiyonu durdurma basamağında kullanıldı.

Standart Solüsyonları ve Hazırlanması

1. Stok standart solüsyonların hazırlanması

a. Standartlar (liyofilize rekombinan IFN, IL4, IL12(p40), IL1, IL8 ve sIL2R) oda ısısına getirildi.

b. Bir mililitre deiyonize su ile stok solüsyon oluşturuldu, karıştırıcı yardımı ile hafifçe karıştırıldı ve 15 dakika bekletildi.

c. Bu sürenin hemen sonunda stok solüsyonlar, 50’şer µl olarak polipropilen ependorflara bölündü.

d. Kullanıma kadar -80°C’de saklandı.

2. Standart solüsyonların seri sulandırımlarının hazırlanması

IFN: Stok standart solüsyonundan (100 ng/ml), çalışma solüsyonu kullanılarak 300pg/ml’bir standart solüsyon hazırlandı. Diğer standart sulandırımları, 300 pg/ml konsantrasyondan başlayarak, 2.3 pg/ml konsantrasyona kadar çalışma solüsyonu ile iki kat seyreltilerek hazırlandı.

IL4: Stok standart solüsyonundan (118 ng/ml), çalışma solüsyonu kullanılarak 500 pg/ml’lik bir standart solüsyon hazırlandı. Diğer standart sulandırımları, 500 pg/ml konsantrasyondan başlayarak, 3.9 pg/ml konsantrasyona kadar çalışma solüsyonu ile iki kat seyreltilerek hazırlandı.

IL12(p40): Stok standart solüsyonundan (135 ng/ml), çalışma solüsyonu kullanılarak 2000 pg/ml’lik bir standart solüsyon hazırlandı. Diğer standart sulandırımları 2000 pg/ml konsantrasyondan başlayarak, 7.8 pg/ml konsantrasyona kadar çalışma solüsyonu ile iki kat seyreltilerek hazırlandı.

IL1: Stok standart solüsyonundan (35 ng/ml), çalışma solüsyonu kullanılarak 250 pg/ml’lik bir standart solüsyon hazırlandı. Diğer standart sulandırımları 250 pg/ml konsantrasyondan başlayarak, 1.9 pg/ml konsantrasyona kadar çalışma solüsyonu ile iki kat seyreltilerek hazırlandı.

IL8: Stok standart solüsyonundan (38 ng/ml), çalışma solüsyonu kullanılarak 200 pg/ml’lik bir standart solüsyon hazırlandı. Diğer standart sulandırımları 200 pg/ml konsantrasyondan başlayarak, 3.1 pg/ml konsantrasyona kadar çalışma solüsyonu ile iki kat seyreltilerek hazırlandı.

sIL2R: Stok standart solüsyonundan (45 ng/ml), çalışma solüsyonu kullanılarak 500 pg/ml’lik bir standart solüsyon hazırlandı. Diğer standart sulandırımları 500 pg/ml konsantrasyondan başlayarak, 3.9 pg/ml konsantrasyona

3.6.1.2 Testlerin Uygulanışı

3.6.1.2.1 IFN, IL4, IL12(p40), IL8 Sitokin ve sIL2R Sitokin Reseptörü ELISA Testlerinin Uygulanışı

1. ELISA plakları (Greiner Bio-one, 655061) kaplama solüsyonu kullanılarak, 1/250 oranında sulandırılmış olan anti-insan sitokin/sitokin reseptörü (IFN, IL4, IL12(p40), IL8, sIL2R) mAb’u (yakalayıcı Ab) ile 100 µl/çukur olacak şekilde kaplandı ve üzerleri kapatılarak, bir gece +4°C’de inkübe edildi.

2. Ertesi gün boşaltılan plaklar, 300 l/çukur olacak şekilde üç kez, yıkama solüsyonu ile yıkandı. Son yıkamadan sonra plaklar ters çevrilerek, emici bir kağıt üzerinde fazla solüsyonu uzaklaştırmak üzere kurutuldu.

3. Plaklar, çalışma solüsyonu kullanılarak, 200 l/çukur olacak şekilde bir saat, oda ısısında bloklama işlemine tabii tutuldu.

4. Bloklama işlemi sonunda boşaltılan plaklar, 300 µl/çukur olacak şekilde üç kez, yıkama solüsyonu ile yıkandı.

5. Hasta ve kontrol gruplarının özgün in vitro proliferasyon kültürlerinden elde edilen üst sıvılar ve serum örnekleri, çalışma solüsyonu ile 1/2 oranında seyreltildi ve 100 l/çukur olacak şekilde dağıtıldı. Seri sulandırımları çalışma solüsyonu içinde belirtildiği şeklide yapılmış olan rekombinan insan IFN, IL4, IL12(p40), IL8 ve sIL2R, 100 µl/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı. Plaklar, üzerleri kapatılarak, iki saat oda ısısında inkübe edildi.

6. İnkübasyon sonunda plaklar, 300 µl/çukur olacak şekilde beş kez, yıkama solüsyonu ile yıkandı.

7. Biotinle işaretli anti-insan IFN, IL12(p40), IL8 mAb’u (saptayıcı Ab) çalışma solüsyonu kullanılarak, 1/250 oranında sulandırıldı. Biotinle işaretli anti-insan IL4 ve sIL2R mAb’u (saptayıcı Ab) ise, çalışma solüsyonu kullanılarak, 1/500 oranında sulandırıldı. Bu şekilde hazırlanan solüsyonlarda, kullanımdan 15 dakika önce, 1/250 oranında SAv-HRP sulandırılarak iyice karıştırıldı. Bu son karışım (working detector), 100 l/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı. Plaklar, üzerleri kapatılarak, bir saat oda ısısında, inkübe edildi.

8. İnkübasyon sonunda plaklar, yıkama solüsyonunda 30 saniye ile bir dakika süresince bırakılarak, yedi kez yıkandı.

9. Son yıkamadan 15 dakika önce, eşit hacimde substrat miyarı A ve B karıştırılarak hazırlanan substrat solüsyonu, 100 l/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı. Plaklar, 30 dakika, oda ısısında, karanlık bir ortamda, üzerleri kapatılmadan inkübe edildi.

10. Bu sürenin sonunda, reaksiyon durdurucu solüsyon, 50 l/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı

11. Plaklardaki reaksiyon, reaksiyon durdurucu solüsyon aktarıldıktan sonra 30 dakika içinde, 450 nm dalga boyunda ELISA okuyucusunda okutularak değerlendirildi.

12. WinCurveFit version 1.1 bilgisayar programıyla kullanılarak, standartların optik dansite değerlerinden standart eğrisi oluşturuldu ve örneklerdeki sitokin ve sitokin reseptör değerleri buna göre hesaplandı.

3.6.1.2.2 IL1 Sitokin ELISA Testinin Uygulanışı

1. ELISA plakları (Greiner Bio-one, 655061) kaplama solüsyonu kullanılarak, 1/250 oranında sulandırılmış olan anti-insan IL1 mAb’u (yakalayıcı Ab) ile 100 l/çukur olacak şekilde kaplandı ve üzerleri kapatılarak, bir gece +4°C’de inkübe edildi. 2. Ertesi gün boşaltılan plaklar, 300 l/çukur olacak şekilde üç kez, yıkama

solüsyonu ile yıkandı. Son yıkamadan sonra plaklar ters çevrilerek, emici bir kağıt üzerinde fazla solüsyon uzaklaştırılmak üzere kurutuldu.

3. Plaklar, çalışma solüsyonu kullanılarak, 200 l/çukur olacak şekilde bir saat, oda ısısında bloklama işlemine tabii tutuldu.

4. Bloklama işlemi sonunda boşaltılan plaklar, 300 l/çukur olacak şekilde üç kez, yıkama solüsyonu ile yıkandı.

5. Hasta ve kontrol gruplarının özgün in vitro proliferasyon kültürlerinden elde edilen üst sıvılar ve serum örnekleri, çalışma solüsyonu ile 1/2 oranında seyreltildi ve 100 l/çukur olacak şekilde dağıtıldı. Seri sulandırımları çalışma solüsyonu içinde belirtildiği şeklide yapılmış olan rekombinan insan IL1, 100 l/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı. Plaklar, üzerleri kapatılarak, iki saat oda ısısında inkübe

6. İnkübasyon sonunda plaklar, 300 µl/çukur olacak şekilde beş kez, yıkama solüsyonu ile yıkandı.

7. Biotinle işaretli anti-insan IL1, mAb’u (saptayıcı Ab) çalışma solüsyonu kullanılarak, 1/250 oranında sulandırıldı ve 100 µl/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı. Plaklar, üzerleri kapatılarak, bir saat oda ısısında inkübe edildi.

8. İnkübasyon sonunda plaklar, 300 l/çukur olacak şekilde beş kez, yıkama solüsyonu ile yıkandı.

9. Yıkamalardan sonra, SAv-HRP, çalışma solüsyonu kullanılarak, 1/250 oranında sulandırıldı ve 100 l/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı. Plaklar, 30 dakika oda ısısında inkübe edildi.

10. İnkübasyon sonunda plaklar, yıkama solüsyonunda 30 saniye ile bir dakika süresince bırakılarak, yedi kez yıkandı.

11. Son yıkamadan 15 dakika önce, eşit hacimde substrat miyarı A ve B karıştırılarak hazırlanan substrat solüsyonu, 100 l/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı. Plaklar, 30 dakika, oda ısısında, karanlık bir ortamda, üzerleri kapatılmadan inkübe edildi.

12. Bu sürenin sonunda, reaksiyon durdurucu solüsyon, 50 l/çukur olacak şekilde plaklara aktarıldı

13. Plaklardaki reaksiyon, reaksiyon durdurucu solüsyon aktarıldıktan sonra 30 dakika içinde, 450 nm’de ELISA okuyucusunda okutularak değerlendirildi.

14. WinCurveFit version 1.1 bilgisayar programı kullanılarak, standartların optik dansite değerlerinden standart eğrisi oluşturuldu ve örneklerdeki sitokin değerleri buna göre hesaplandı.