İşlemsel Yükselteç ile Yüksek Geçiren Filtre Devresi Uygulaması

Os flavonóides são compostos polifenólicos, encontrados em frutas, sementes, legumes, ervas, mel, dentre outros alimentos da dieta consumidos cotidianamente (KOES e QUATTROCCHIO, 1994). Os flavonóides possuem propriedades antinflamatórias, antioxidantes, antiapoptótica, vasodilatadoras, antialérgicas, antiplaquetária, antitumorais e antimicrobianas (RATTY e DAS, 1998). Vários estudos têm demonstrado a capacidade dos flavonóides em melhorar a cognição e prevenir danos neuronais causados por isquemia cerebral induzida em modelos animais (FU et al., 2014; MIAO et al., 2014; DONG et al., 2013).

Os flavonóides são dividos em classes: flavonas, flavanonas, flavonóis, auronas, isoflavonas, flavanas, antocianidinas, leucoantocianidinas, chalconas, neoflavonóides, proantocianidinas (Bravo, 1998). Particularmente, a classe das flavanonas se destaca por serem compostos encontrados em altas concentrações nos cítricos e em algumas ervas. As flavanonas são representadas pelos compostos: eriodictiol, naringenina, naringina e hesperidina.

Vários estudos reportaram a capacidade das flavanonas em inibir o processo inflamatório (WU et al., 2015), o estresse oxidativo (KOCYIGIT, et al., 2015) e a apoptose (MUTHAIAH, et al., 2013), bem como as ações benéficas sobre déficits cognitivos, por exemplo, a naringenina preveniu animiais de déficitis de memória ocasionados por modelo de Alzheimer induzido (MA et al., 2013). Por essa razão, é relevante dar continuidade a investigação dos efeitos neuroprotetores de outras flavanonas, como por exemplo, o eriodictiol, que demonstrou proteger animais do dano cerebral isquêmico. No entanto, não existem na literatura estudos que relatem seus efeitos sobre déficits de memória.

1.6. Eriodictiol

O eriodictiol (γ‟,4‟,5,7-tetrahidroxiflavanona) (Etiol) (ROSSATO, et al., 2011), é um flavonóide da classe das flavanonas (HAVSTEEN, 1983). É um metabólito secundário que pode ser encontrado em frutas cítricas, como o limão e em algumas ervas, como na erva chinesa (Dracocephalum rupestre) (LOU et al., 2012), na erva santa (Eriodictyon californicum) (JAKOB et al., 2005) e na erva-de-mula (Vernonia tweedieana) (ROSSATO, 2010). O Etiol mostrou efeito antinociceptivo eficaz a partir da dose de 4,5 mg/kg por via oral em ratos (Figura 7) (ROSSATO, 2010).

Figura 07. Estrutura molecular do eriodictiol

Vários estudos foram realizados com intuito de conhecer a farmacocinética do eriodictiol. Quando absorvido no intestino, é convertido em sua forma aglicona e metabolizado por metilação, originando outros flavonoides, a hesperetina e o hemoeriodictiol (Miyake et al., 2000).

O eriodictiol possui propriedades terapêuticas reportadas, incluindo propriedade antiinflamatória, antialérgica, antimicrobiana, antitumoral (LEE, 2011) e antioxidante (HU et al.,2012;. LOU et al., 2012). Eriodictiol reduziu significativamente o infarto cerebral e déficits neurológicos em ratos submetidos à isquemia cerebral focal transitória (Jing et al., 2013). Ainda, reprimiu a neurotoxicidade induzida pelo H2O2 em cultura de células de feocromocitoma em ratos (PC12) (LOU et al., 2012).

O eriodictiol-7-O-glucosideo possui a capacidade de ativar Nrf2 (Nuclear factor E2related) (HU et al., 2012). O Nrf2 é um fator de transcrição que regula a expressão de proteínas antioxidantes, atuando como protetor em lesões por estresse oxidativo e inflamação

(OURO et al., 2012). O eriodictiol-7-O-glucosideo mostrou estabilizar a degradação de Nrf2, resultando no seu acúmulo. Estudos recentes têm sugerido que a Nrf2 confere proteção contra a toxicidade induzida pela cisplatina numa linhagem de HRMC (Human Renal Mesangial Cell) (HU et al., 2012).

O tratamento com eriodictiol suprimiu significativamente a morte celular induzida por luz ultravioleta (UV) em queratinócitos humanos (células NHEK, do inglês Normal Human Epidermal Keratinocyte), através da redução da apoptose e da clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase e inibiu concomitantemente a ativação da caspase-3 e a produção de ROS (LEE, et al., 2011). O eriodictiol também mostrou efeito direto sobre o sistema vascular. Foi evidenciado seu efeito vasodilatador sobre anéis de aórtica torácica de ratos. O eriodictiol diminuiu significativamente as contrações endoteliais induzidas por noradrenalina (NA) e cloreto de potássio (KCl). Esse efeito vasodilatador mostrou estar parcialmente relacionada com a inibição do influxo de Ca++ ou com outra proteína enzimática subsequente a ativação de PKC (Protein Kinase C) envolvida com a ativação de proteínas contráteis como a MLCK (Myosin Light Chain Kinase) (ROJAS et al., 1999).

Lee, (2011) mostrou a capacidade anti-inflamatória do eriodictiol através da redução de óxido nítrico (NO) e citocinas pro-inflamatórias produzidas a partir de LPS de células RAW 264.7. Ainda, demonstrou que o eriodictiol foi capaz de suprimir a atividade fagocítica dos macrófagos. O bloqueio do NF-kB mostrou ser o mecanismo molecular envolvido nessa ação antinflamatória. Em outro trabalho, Lee et al. (2013) mostrou que o eriodictiol inibiu a produção de citocinas pró-inflamatórias estimuladas por LPS via bloqueio de TLR4/CD14 seguido de p38 MAPK, ERK1/2, JNK, e regulação da COX-2. Estes achados sugerem que o eriodicitiol pode ser útil na inibição da produção de mediadores inflamatórios, quimiotaxia, infiltrado leucocitário e ativação glial presentes no processo inflamatório do AVE. No entanto, os efeitos do eriodictiol sobre a neuroinflamação (in vivo) e sobre os déficits de memória após a oclusão permanente da artéria cerebral média (pMCAO) encontram-se desconhecidos.

2. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA

O Acidente vascular encefálico é a terceira principal causa de morte humana. O dano inflamatório desempenha um papel importante na patogênese da isquemia cerebral e constitue um alvo para a prevenção e tratamento (ZHAO et al., 2014). Terapias anti-inflamatórias têm mostrado serem eficazes na redução do dano isquêmico e déficits de memória ocasionados por modelos de AVE experimental (HUANG et al., 2014).

As medidas preventivas no combate aos riscos de AVE, como, o controle da pressão arterial, combate ao tabagismo e controle dos níveis de colesterol e da diabetes, são focos da promoção à saúde realizada pelo o governo, no entanto, o Brasil ainda possui altas taxas de mortalidade devido ao AVE (GARRITANO et al, 2012).

Assim se faz necessária a busca por substâncias que possam atuar na neuroproteção de pacientes de risco. Apesar de muitos estudos buscarem drogas neuroprotetoras para a isquemia cerebral (AHMED, et al., 2000; HALEY, 1998), poucos se mostraram realmente efetivos (TAZAKI, et al., 1988). O presente estudo visa investigar se o eriodictiol, por suas ações anti-inflamatórias e antioxidantes possa vir a ser uma estratégia terapêutica no tratamento do AVE.

3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral

Estudar os efeitos do eriodictiol sobre o dano neuronal, memória e resposta inflamatória de camundongos submetidos à isquemia cerebral focal permanente.

3.2. Objetivos Específicos

Estudar os efeitos do eriodictiol em camundongos submetidos à isquemia cerebral focal permanente, analisando os seguintes aspectos:

 Disfunção mitocondrial (TTC);

 Alterações sensório-motoras e déficits de memória;

 Viabilidade neuronal através da coloração de cresil-violeta no córtex temporal e estriado dos animais isquemiados.

 Neuroinflamação através de determinação da atividade de MPO e imunohistoquímica para mediadores inflamatórios (TNF-α e iNOS) e ativação astrocitária (GFAP) no córtex temporal e estriado de animais isquemiados;

4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Animais

Foram utilizados camundongos albinos adultos Swiss, machos, pesando entre 25 e 30g, provenientes do Biotério Central do Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (UFC) e transferidos para o Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina - UFC. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas apropriadas, forradas com raspas de madeira, com ciclo de claro/escuro de 12h/12h e alimentados com ração padrão e água à vontade. No que se refere aos cuidados com os animais, este estudo seguiu os princípios éticos da experimentação animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O estudo foi submetido à Comissão de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC sob o número de registro 90/2013.

4.2 Drogas

Eriodictiol 10mg (Sigma-Aldrich, EUA); Cloridrato de xilazina 2% (Kensol® Laboratórios König S.A, Argentina); Cloridrato de ketamina 5% (Vetanarcol®, Laboratórios König S.A, Argentina). Todos os reagentes utilizados eram de grau analítico.

4.3 Protocolo experimental

Foram utilizados 128 animais divididos entre os grupos falso-operados tratados com veículo ou eriodictiol (Etiol) na dose de 4 mg/kg, isquemiados (pMCAO) tratados com veículo e isquemiados (pMCAO) tratados com Etiol nas doses de 1, 2, e 4 mg/kg por via oral (v. o.) (Tabela 01). A dose maior de Etiol (4 mg/kg) escolhida para esse estudo foi baseada nos resultados de Rossato, (2010) que demonstrou que o tratamento com Etiol a partir da dose de 4,5 mg/kg foi capaz de reduzir significativamente a nocicepção induzida por capsaicina. O Etiol foi solubilizado (5% Tween 80 em salina 0,9%). Os animais foram tratados com Etiol 30 minutos antes da indução isquêmica por eletrocoagulação da artéria cerebral média e 1 hora depois. Nos dias que se seguiram a cirurgia, as doses de 1, 2 e 4 mg/kg foram administradas 1 vez ao dia.

Para a realização dos testes comportamentais foram seguidos 4 protocolos experimentais. Protocolo 1: 24 horas após a indução da isquemia foi realizada a avaliação neurológica e a análise da área do infarto cerebral pelo método do TTC (n=6/grupo). Protocolo 2: 24 horas após a indução da isquemia, os animais foram eutanaziados e seus cérebros foram dissecados (córtex temporal e corpo estriado), seguido de dosagem bioquímica

nessas estruturas cerebrais para avaliar a atividade enzimática de MPO (n=6/grupo). Protocolo 3: 72 horas após a cirurgia foram realizados os testes de campo aberto, labirinto em Y e esquiva passiva (memória recente) e 96 horas após o teste da esquiva passiva (memória tardia) (n=8/grupo). Ao final do protocolo 3 os animais foram perfundidos com paraformolaldeído 4% e seus cérebros, dissecados e fixados com formol tamponado por 24 horas. Logo após, os cérebros foram armazenados em sacarose até serem cortados no criostato. Após a realização dos cortes, as fatias foram armazenadas em geladeira “free floating” em PBS e foram utilizadas para as técnicas de imunohistoquímica (TNF-α, iNOS e GFAP) e para as técnica de histologia (Cresil-violeta). (Figura 8).

Tabela 01. Grupos de tratamento. Grupo Tratamento

FO Animais falso-operados e tratados com veículo (5% Tween 80 salina 0,9%) v.o. FO + Etiol 4 Animais falso operados e tratados com Etiol na dose de 4 mg/kg v.o.

pMCAO Animais submetidos à pMCAO tratados com veículo v.o.

pMCAO+Etiol 1 Animais submetidos à pMCAO tratados com 1 mg/kg de Etiol v.o. pMCAO+Etiol 2 Animais submetidos à pMCAO tratados com 2 mg/kg de Etiol v.o. pMCAO+Etiol 4 Animais submetidos à pMCAO tratados com 4 mg/kg de Etiol v.o.

Figura 08. Delineamento experimental.