Humoral İmmun Yanıtı Ölçen Testler

Enfeksiyonun teşhisinde Map’e karşı gelişen spesifik antikorları saptayan AGID, ELISA ve KFT gibi serolojik testler kullanılmaktadır (OIE, 2008; OIE, 2018). Paratüberkülozun ileri evrelerine gelinceye kadar antikor yanıtının oluşmaması nedeniyle enfeksiyonun erken dönemlerinde serum örneklerinde antikor tespitine dayanan testlerin hastalığın teşhisi için uygun olmayacağı belirtilmiştir (Nielsen, 2010; OIE, 2008; OIE, 2018).

2.7.2.2.1. Agar Jel İmmunodifüzyon (AGID) Testi

Serum örnekleri ile yapılan AGID testinin spesifitesi yüksek, hayvan türlerinden nispeten bağımsız, basit ve ucuz bir yöntem olduğu belirtilmiştir (Eamens ve ark., 2015). AGID testinin enfeksiyonun başlangıç aşamalarında düşük sensitiviteye sahip olduğu, ancak klinik olarak paratüberküloz olduğu düşünülen sığır, koyun ve keçilerde hastalığı doğrulamak amacıyla kullanılabileceği açıklanmıştır (Nielsen, 2010; Sergeant ve ark., 2003). Yeni Zelanda ve Avustralya'da koyun ve keçilerde yapılan serolojik araştırmalarda (Gwozdz ve ark., 2000; Hope ve ark., 2000; Sergeant ve ark., 2003), AGID testinin sensitivite (%38-56) ve spesifitesi (%100) ELISA testlerinden (sensitivite %35-54, spesifite %95-99) az da olsa yüksek saptanmıştır. Ancak Gumber ve ark. (2006), koyun ve keçi serumlarında ticari bir ELISA kiti ile AGID testini karşılaştırdıklarında ELISA’nın AGID testinden daha duyarlı olduğunu belirtmiş ve paratüberkülozdan ari koyun ve keçi sürülerinde ise ELISA testinin spesifitesinin %100 olacağını ileri sürmüştür. Histolojik incelemeler ile kıyaslandığında ise AGID testinin spesifite ve sensitivitesi %95 güven aralığında sırasıyla %99-100 ve %38-56 olarak saptanmıştır (Hope ve ark., 2000).

2.7.2.2.2. Komplement Fikzasyon Testi (KFT)

Komplement fikzasyon testi, sığırlar için uzun yıllar standart bir test olarak kabul edilmiştir (OIE, 2008). KFT’nin klinik olarak paratüberküloz şüpheli hayvanlarda iyi sonuç vermesine rağmen, hem sensitivite hem de spesifitesinin düşük olduğu bildirilmiştir (Chaubey ve ark., 2016; Sohal ve ark., 2007). Bu nedenle genel

49

kontrol amacıyla kullanılamayacağı, ancak sığır ithal eden ülkeler tarafından talep edildiği takdirde uluslararası kabul gören KFT prosedürlerinin uygulanabileceği bildirilmiştir (OIE, 2008; OIE, 2018).

2.7.2.2.3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Hem serum hem de süt örneklerinde Map’e karşı gelişen spesifik antikor yanıtını tespit ederek enfeksiyonu dolaylı yoldan teşhis eden ELISA testleri yaygın olarak kullanılmaktadır (OIE, 2008; OIE, 2018). Özellikle sürü taramalarında geçerli kabul edilen, düşük maliyetli, uygulaması kolay ve hızlı olan testlerdir (OIE, 2008; OIE, 2018; Weber ve ark., 2009). Bununla birlikte testin spesifite sorunlarının yanı sıra enfeksiyonun farklı aşamalarında hücresel ve humoral bazda farklı immun yanıtların şekillenmesi ve özellikle enfeksiyonun subklinik aşamasında düşük sensitiviteye sahip olması nedeniyle kullanımında sınırlamalar olduğu bildirilmiştir (Ayele ve ark., 2001; Collins, 1996; Maroudam ve ark., 2015; Nielsen, 2010). Nielsen (2010), enfekte sığırlarda tespit edilebilir düzeyde gaita ile Map atılımı başlamadan önce antikor üretiminin olabileceğini, ancak Map atılımının çok az olduğu hayvanlarda yani enfeksiyonun erken evrelerinde antikorların tespit edilemeyebileceği belirtmiştir. Günümüzde paratüberkülozun tanısında kullanılan ve ticari olarak temin edilebilen çeşitli ELISA kitleri bulunmaktadır (Harris ve Barletta, 2001; Maroudam ve ark., 2015; OIE, 2008; OIE, 2018). Geliştirilen bu ELISA kitlerinde Map’in farklı antijenleri kullanılmış ve çapraz reaksiyonları önlemek amacıyla örneklerin M. phlei ile ön absorpsiyonu yapılarak testin spesifitesi arttırılmıştır (Harris ve Barletta, 2001; Maroudam ve ark., 2015; OIE, 2008; OIE, 2018). Map’e spesifik bir antijen olan LAM’ın kullanıldığı testlerde ise ön absorpsiyonun gerekli olmadığı bildirilmiştir (Harris ve Barletta, 2001; Maroudam ve ark., 2015; OIE, 2008; OIE, 2018). Paratüberküloz teşhisinde kullanılan ticari ELISA kitlerinin spesifiteleri genellikle %95'in üzerinde olarak belirtilmiş olmasına rağmen, sensitivite ve spesifiteler arasında büyük farklar olduğu ileri sürülmüştür (Harris ve Barletta, 2001; Maroudam ve ark., 2015; Nielsen ve Toft, 2008).

50

Kültür yönteminde olduğu gibi testin sensitivitesinin enfeksiyonun aşamasına,

Map’in gaita ile atılım düzeyine ve hayvanların yaşına bağlı olarak değişebileceği

bildirilmiştir (Eamens ve ark., 2015; Nielsen ve Toft, 2008; OIE, 2008; OIE, 2018). Nitekim Map ile enfekte hayvanların saptanması için kullanılan antikor ELISA’nın sensitivitesinin düşük (yaklaşık %5-30) olduğu, ancak yaşın ilerlemesiyle birlikte testin sensitivitesinin arttığı rapor edilmiştir (Nielsen ve Toft, 2006). ELISA testinin, KFT veya AGID’a göre sensitivite ve spesifitesinin daha yüksek olduğu açıklanmış (Ayele ve ark., 2001; Chaubey ve ark., 2016; Nielsen, 2010; Sohal ve ark., 2007) olmasına rağmen, testin sensitivitesinin klinik olgularda KFT ile benzer, subklinik enfekte hayvanlarda ise KFT’den daha yüksek olduğunu ileri sürülmüştür (Ayele ve ark., 2001; Chaubey ve ark., 2016). Whitlock ve ark. (2000), gaita kültürü ile paratüberküloz olduğu tespit edilen sığırların ancak %30-40’ının ELISA ile pozitif saptandığını bildirmiştir. ELISA sensitivitesinin 2, 3 ve 4 yaşındaki sığırlarda sırasıyla %1,2; %8,9 ve %11,6 olarak hesaplandığı bir çalışmada (Jubb ve ark., 2004), daha ileri yaştaki hayvanlarda bu oranın %20-30 arasında olduğu rapor edilmiş ve tüm yaş grupları için hesaplandığında testin ortalama sensitivitesi yaklaşık %15 olarak belirlenmiştir.

Süt örneklerinde ELISA ile enfeksiyona spesifik antikorların saptanabileceği bildirilmiştir (Hendrick ve ark., 2005; OIE, 2008). Hendrick ve ark. (2005), 689 sığırdan alınan süt ve kan serumu örneklerinin sırasıyla 77 (%11,2) ve 130 (%18,9)’unda pozitiflik saptadıkları halde süt ELISA ve fekal kültür (%10,4) arasında aynı sonuçları elde ettiklerini bildirmiş ve süt ELISA testinin hastalığın teşhisi için uygun bir yöntem olduğunu ileri sürmüştür. Benzer bir çalışma (Salgado ve ark., 2007) keçiler üzerinde yapılmış, serum ve süt örnekleri kullanılarak uygulanan ELISA testlerinin sırasıyla sensitivitesi %74,3 ve %60; spesifiteleri ise %98,6 ve %99,3 olarak hesaplanmıştır.

Histolojik inceleme sonucu paratüberküloz olarak saptanan koyunların spesifitesi %98,2-%99,5 arasında olan ticari bir ELISA kiti ile ancak %35-54'ünün pozitif tespit edildiği bildirilmiştir (Hope ve ark., 2000). Sergeant ve ark. (2003), koyunlarda kendileri tarafından geliştirilen ELISA testini histolojik inceleme sonuçları ile karşılaştırmış ve testin spesifitesini %99, sensitivitesini ise %21 olarak

51

hesapladıklarını bildirmiştir. Enfekte (9 sürü, 2015 hayvan) ve enfekte olmayan (5 sürü, 450 hayvan) koyun sürülerinde AGID, ELISA ve deri testinin sensitivite ve spesifitesinin karşılaştırıldığı bir çalışmada (Robbe-Austerman ve ark., 2006b); AGID ve ELISA testlerinin spesifik olmasına rağmen sensitivitelerinin düşük saptandığına ve testlerin sensitivite ile spesifitelerinin sırasıyla %8,3; %8-16,3; %73,3 ve %99,5; %99,3-97,5; %98.7 olarak tespit edildiğine dikkat çekilmiştir. Koyun suşu ile oral yolla enfekte edilen 12-16 haftalık merinos kuzuların bağırsak ve lenfoid dokularından

Map’in izole edildiği ve deri ile IFN-γ testleri sonucunda da pozitiflik saptandığı halde

enfekte edilen bu kuzulardan sadece birinin inokülasyondan 14 hafta sonra ELISA testinde pozitif sonuç verdiği belirlenmiştir (Reddacliff ve Whittington, 2003).