HİSTOPATOLOJİK BULGULAR

Deneysel çalışma sonunda gruplardaki deneklerin ince bağırsaklarında oluşan hasarların histopatolojik sonuçları Tablo 9’da gösterildi.

Tablo 9. Grupların patolojik değerlendirmesi

Patoloji (Chiu Klasifikasyonuna göre) K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p Level 0 %100 (n=10) 0 0 0,000* Level 1 0 0 %70 (n=7) Level 2 0 0 %30 (n=3) Level 3 0 0 0 Level 4 0 %100 (n=10) 0 Level 5 0 0 0

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: deney+ilaç uygulanan grup.

Grupların patolojik değerlendirmesi Tablo 9’da gösterilmiştir. Gruplar patoloji sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark bulundu (p<0,001). Bu farkın kontrol grubu ile deney grubu (p<0,001) ve deney+ilaç grubu (p<0,001) arasında, deney grubu ile deney+ilaç grubu arasında (p<0,001) olduğu görüldü (Şekil 16-17-18).

Şekil 16. Kontrol grubunda Level 0 görüntüsü. (HE, X100)

TARTIŞMA

Bir organa gelen kan akımının çeşitli nedenlerle kesilmesine iskemi denir (10, 88). Reperfüzyon ise dokunun kanlanmasının yeniden başlamasıdır. Serbest oksijen radikallerinin salınımı doku reperfüzyonu esnasında, kandaki oksijen konsantrasyonunun hızlı artışına bağlıdır. Sağlıklı bir kişide vücutta oksidan ve antioksidan düzeyleri denge halindedir (33, 89).

Oluşan serbest oksijen radikalleri çeşitli hücresel savunma mekanizmalarıyla enzimatik veya nonenzimatik yol ile zararsız duruma getirilirler. İskemi reperfüzyon modellerinde çeşitli bitkisel kaynaklı eksojen antioksidanlar kullanılmaktadır (14, 43, 45, 90).

Organlarda sadece iskemi sonrasında değil, reperfüzyon sonrasında da oluşan hasara bağlı fonksiyon bozuklukları görülür. Son yıllarda, iskemik hasara bağlı mukozal lezyonların gelişiminde iki mekanizma üzerinde durulmaktadır. Bunlar, oksijen radikallerinin dengesiz artışı ve iskemi sırasındaki fosfolipaz A2’nin aktivasyonudur. Hücre membranının oksijen

radikalleri ile reaksiyonu sonucu lipid peroksidasyonu ile birlikte hücre ölümü başlar. Antioksidan ajanların kullanımının, bağırsak I/R hasarını azalttığını gösteren çalışmalar mevcuttur. (91).

Karnosol biberiye bitkisinde (Rosmarinus officinalis) bol bulunan fenolik yapıda bir moleküldür. Antioksidan olduğu uzun yıllardır bilinen biberiyenin bu antioksidan özelliğinin %90’ı içeriğinde bulunan karnosol’a aittir.

Literatür taramalarında barsak iskemi reperfüzyonun sebep olduğu akciğer (92), karaciğer (82, 93), renal (90, 94) hasar modellerinde karnosol’un antioksidan, antiinflamatuar ve antikanser etkileri üzerinde durulmuştur.

Bizde çalışmamızda deneysel intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası kan, karaciğer, dalak ve mezenter kültürlerinde oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite artışı üzerine biberiye “Rosemarinus officinalis” ekstresi olan karnosol’un koruyucu etkisinin olup olmadığını araştırmayı amaçladık.

Bir inflamatuar sitokin olan Tümör nekrotizan faktör-alfa (TNF-α)’nın oksidatif stres oluşturarak karaciğer hücre hasarına neden olduğu bildirilmektedir. TNF-α’yı harekete geçiren mekanizmanın NF-KB sinyal yolları olduğu gösterilmektedir (95, 96).

Tsai ve arkadaşlarının (97) inflamasyonun önlenmesinde karnosol’un TNF-α düzeyine etkisini araştırdıkları in vitro çalışmada; karnosol verilen grupta TNF-α düzeyindeki artışın baskılandığı bildirilmiştir.

Mengoni ve arkadaşları (98) ise farklı biberiye ekstrelerininin uygulandığı ratlarda yapmış oldukları çalışmada inflamasyonun engellenmesinde karnosol’un diğer ekstrelere göre daha etkili olduğunu, daha düşük dozlarda bile TNF-α değerlerini düşürdüğünü bildirmişlerdir.

Yapılan birkaç deneysel çalışmada da karnosol’un sitoprotektif mekanizmaları indükleyerek özellikle TNF-α ekspresyonunu inhibe ederek güçlü bir antiinflamatuar ajan olduğu gösterilmiştir (78, 81-83) .

Bizim çalışmamızda ise serum TNF-α sonuçları açısından gruplar karşılaştırıldığında kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken, serum TNF-α sonuçlarının, hem kontrol grubuna hem de karnosol uygulanan grupta iskemi-reperfüzyon oluşturulan gruba göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu. Buna göre literatürle uyumlu olarak karnosol’un güçlü antiinflamatuar etkisinin olduğunu gördük.

Bir diğer proinflamatuar faktör ise IL-6’dır. Tian ve ark. (92) ile Yao ve ark. (93)’nın yaptıkları deneysel çalışmalarda karnosol’un lökositlerin aktive olmasını sağlayan proinflamatuar faktör IL-6 düzeylerinde azalmaya yol açtığı gösterilmiştir.

Bizim çalışmamızda ise serum IL-6 sonuçları açısından gruplar karşılaştırıldığında kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmazken, serum IL-6 sonuçlarının, hem kontrol grubunda hem de karnosol uygulanan grupta iskemi-reperfüzyon oluşturulan gruba göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu. Karnosol, TNF-α gibi IL-6 düzeylerinde de istatistiksel olarak anlamlı azalmaya yol açmıştır.

Tsai ve arkadaşları (97) ratlarda yaptıkları çalışmada inflamasyonun önlenmesinde karnosol’un bir başka inflamatuar sitokin olan IL-1β düzeyine etkisini araştırmışlar, karnosol verilen grupta IL-1β düzeyindeki artışın baskılandığı bildirmişlerdir.

Mengoni ve arkadaşları (98) ise farklı biberiye ekstreleri uyguladıkları ratlarda inflamasyonun engellenmesinde karnasolün diğer ekstrelere göre daha etkili olduğunu, daha düşük dozlarda bile IL-1β değerlerini düşürdüğünü bildirmişlerdir.

Bizim çalışmamızda ise serum IL-1β sonuçları açısından gruplar karşılaştırıldığında kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken, serum IL-1β sonuçlarının, hem kontrol grubuna hem de karnosol uygulanan grupta iskemi-reperfüzyon oluşturulan gruba göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu. Çalışmamızda karnosol’un TNF-α ve IL-6 gibi IL-1β üzerine de etkili olan güçlü bir antiinflamatuar ajan olduğu gözlendi.

Bakteriyel translokasyon intestinal lümendeki canlı bakteri ve/veya bakteri ürünlerinin bağırsak bariyerini geçerek lenf düğümleri, karaciğer, dalak ve kan dolaşımına geçtiği durum olarak tanımlanır. Bazı patolojik durumlarda diğer sistemik organlara gastrointestinal lümenden bakteri ve bakteri ürünleri geçişi meydana gelir. Bu sürece bakteriyel translokasyon denir (50).

Yapılan bazı çalışmalarda karnosol’un antioksidan ve antibakteriyel etkilerininin incelemesi neticesinde karnosol’un gram (+) bakterilere gram (–) bakterilerden daha etkili olduğunu bildirmişlerdir (85, 86).

Bernardes ve arkadaşları (99) yaptıkları çalışmada ise Biberiye bitkisinin oral patojenler üzerindeki antimikrobiyal etkisini araştırmışlar. Sonuç olarak Streptococcus

mutans, S. salivarius, S. sobrinus, S. mitis, S. sanguinis, ve Enterococcus faecalis gibi oral

patojenlere karşı Biberiye ekstresi olan karnosol’un güçlü antimikrobiyel etkisinin olduğunu göstermişlerdir.

Oluwatuyia ve arkadaşları (100) yapmış oldukları çalışmada karnosol’un Metisilin Dirençli staphilococcua aureus (MRSA) üzerindeki antibakteriyel ve direnç geliştirme etkisini incelemişler, eritromisin ve tetrasiklin ile karşılaştırdıklarında, MRSA üzerine karnosol’un antibakteriyel etkisinin daha iyi olduğunu bildirmişler.

Bozin ve arkadaşları (101) biberiye ekstresinin antimikrobiyal ve antioksidan faaliyetlerini inceledikleri çalışmalarında karnosol’un antibakteriel etkinliğinin Esherichia

coli, salmonella typhi, S. Enteritidis ve Shigella sonei’de oldukça yüksek olduğunu

bildirmişlerdir.

Yapmış olduğumuz çalışmada karaciğer, dalak ve mezenter kültürü sonuçları açısından karşılaştırıldıklarında iskemi-reperfüzyon oluşturulan grupta üreyen mikroorganizmanın Escherichia coli olduğu görülmüştür. Kontrol grubu ve karnosol uygulanan grupta ise üremeye rastlanmamıştır. Karnosol’un bakteriyel translokasyonu

önleyerek gram (–) bakterilere karşı istatistiksel olarak anlamlı bir etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir.

Kan damarı oluşumunun ana düzenleyicileri anjiyopoetinlerdir. Anjiyopoetinler, damar oluşumu ve remodellingde rol oynayan büyüme faktörleri ailesinde yer alır. Anjiogenezde rol almaları yanında inflamatuar yanıtı da düzenlemektedirler. Anjiyopoetinler arasında en iyi tanımlananlar Ang-1 ve Ang-2’dir. Özellikle perisitlerden Ang-1, endotel hücrelerinden Ang-2 salgılanmaktadır (58).

Anjiyopoetin-1; Tie-2 reseptör agonisti olup damar yapısının ve fonksiyonlarının korunmasıyla birlikte anti-apoptotik ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Lökositlerin endotele adezyonu ve endotelden geçişi, sitokin üretimi, adezyon molekül salınımını ve damar geçirgenliğini inhibe etmektedir (59-61). Anjiyopoetin-1 NF-ĸB aktivasyonunu inhibe ederek inflamatuar sitokin üretiminin azalmasını sağlar ve inflamatuar bir sitokin olan TNF-α’nın etkisine ters yönde etki eder. Ang-1 düşük TNF-α düzeylerinde kontrolsüz bir inflamatuar yanıtı engeller (62). Ang-1 aracılı PKB-Akt sinyali direk olarak endotel hücre apoptozunu önler ve Ang-2 salınmasını önleyerek endotel aktivasyonuna engel olur.

Ancak literatür taramalarında vasküler permeabilite artışı üzerine karnosol’un koruyucu etkisinin olup olmadığını bildiren herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır

Yapmış olduğumuz çalışmada, doku Ang-1 ve Ang-2 sonuçları açısından gruplar değerlendirildiğinde kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında Ang-1 ve Ang-2 sonuçlarının benzerlik gösterdiği görüldü. kontrol ve karnosol uygulanan gruba göre iskemi- reperfüzyon oluşturulan grupta Ang-1 düzeylerinin düşük, Ang-2 düzeylerinin ise yüksek olduğu tespit edildi. Ancak bu farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olmadığı görüldü.

Yao ve arkadaşları (93) deneysel olarak yaptıkları barsak iskemi reperfüzyonun sebep olduğu karaciğer hasarı modelini histapatolojik olarak incelediklerinde tüm ratlarda histolojik değişikliklerin olduğunu, ödem, hemoroji ve nötrofil infiltrasyonu görüldüğünü bunlar yönünden grupları kıyasladıklarında ise karnasol uygulanan ratlarda iskemi reperfüzyon hasarının daha az olduğu bildirilmiştir. Tian ve arkadaşları (92) da deneysel olarak yaptıkları barsak iskemi reperfüzyonun sebep olduğu akciğer hasarı modelinde karnasol kullanımının üstteki literatüre benzer şekilde akciğer hasarını önlemede etkili olduğunu bildirmişlerdir.

Bizim çalışmamızda ise intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası terminal ileumda meydana gelen histopatolojik değişiklikler incelenmiştir. Kontrol grubu ve karnosol uygulanan grup arasında istatistksel olarak anlamlı bir fark bulunmazken, I/R hasarı oluşturulan grup ile karnosol uygulanan grup arasında karnosol lehine istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur.

Sonuç olarak, güçlü antienflamatuar etkisi olduğu bilinen karnosol’un deneysel olarak oluşturulan iskemi reperfüzyon modelinde bakteriyel translokasyon ve ince barsak hasarını önlemedeki etkisinin anlamlı olduğu, vasküler permeabilite artışını önlemedeki beklenen etkisinin ise yeterli olmadığı görülmüştür. Ancak vasküler permeabilite artışını önlemedeki beklenen etkisinin değerlendirilmesinde farklı çalışmaların yapılmasına ihtiyaç vardır.

SONUÇLAR

Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı’nda planlanan çalışmamızda daha önce hiç üzerinde çalışılmayan; sıçanlardaki intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite üzerine karnosol’un koruyucu etkisinin olup olmadığını araştırdık.

Çalışmamız Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarı’nda üniversitemiz Genel Cerrahi, Mikrobiyoloji ve Patoloji Anabilim Dalları ile Gülhane Askeri Tıp Akademisi Biyokimya Anabilim Dalı’nın ortaklaşa çalışması ile gerçekleştirilmiştir.

Deneysel olarak intestinal İ/R oluşturulan ratlardaki karnosol’un etkisinin; sıçanlarda serumda TNF-α, IL-1β ve IL-6 seviyeleri, intestinal doku intestinal Ang-1 ve Ang-2 düzeylerine, karaciğer, dalak ve mezenter doku kültürü ile intestinal dokudaki histopatolojik değişiklikler değerlendirilerek şu sonuçlara ulaşıldı:

1. Serum TNF-α sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken her iki grup, deney grubu ile karşılaştırıldığında serum TNF-α sonuçlarının kontrol grubu ile deney+ilaç grubunda anlamlı derecede düşük olduğu,

2. Serum IL-1β sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken her iki grup, deney grubu ile karşılaştırıldığında serum IL-1β sonuçlarının kontrol grubu ile deney+ilaç grubunda anlamlı derecede düşük olduğu,

3. Serum IL-6 sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken her iki grup, deney grubu ile

karşılaştırıldığında serum IL-6 sonuçlarının kontrol grubu ile deney+ilaç grubunda anlamlı derecede düşük olduğu,

4. Gruplar doku Ang-1 ve Ang-2 sonuçları açısından değerlendirildiğinde, kontrol ve deney+ilaç grubu arasında farklılık olmadığı ancak deney grubunda, kontrol ve deney+ilaç grubuna göre Ang-1 düzeylerinin düşük, Ang-2 düzeylerinin ise yüksek olmasına rağmen bu farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olmadığı,

5. Gruplar karaciğer, dalak ve mezenter kültürü sonuçları açısından değerlendirildiğinde deney grubunda Escherichia coli’nin ürediği, kontrol grubu ve deney+ilaç grubunda ise üreme olmadığı ve karnosol’un bakteriyel translokasyonu önleyici etkiye sahip olduğu,

6. Gruplar patoloji sonuçları açısından değerlendirildiklerinde, kontrol grubu ve deney+ilaç grubu arasında istatistksel olarak anlamlı bir farklılık bulunmadığı, deney grubu ile deney+ilaç grubu karşılaştırıldığında ise karnosol’un intestinal hasarı önleyici etkiye sahip olduğu görülmüştür.

Buna göre; karnosol’un, intestinal iskemi reperfüzyon oluşturulan ratlarda meydana gelen bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite artışını önlemedeki etkinliğini değerlendirdiğimizde biyokimyasal, mikrobiyolojik ve histopatolojik etkilerinin anlamlı düzeyde olumlu olduğu, vasküler permeabilite artışı üzerine olan olumlu etkisinin ise anlamlı olmadığı sonucuna varılmıştır.

ÖZET

İskemi bir dokuya gelen kan akımının azalması veya kesilmesi olarak tanımlanır. Reperfüzyon ise kan akımının yeniden başlamasıdır. İskemi sonrasında dokuda hücresel fonksiyon bozukluklarına neden olacak bir dizi kimyasal olay başlar. Yeniden kanlanma ile dokudaki hasar miktarı giderek artar. Çeşitli nedenlerden oluşan iskemi reperfüzyona bağlı gelişen akut iskemi, vasküler permeabilite artışına ve bakteriyel translokasyona sebep olmaktadır. Deneysel iskemi reperfüzyon modeli üzerinde antioksidanların etkileri ile ilgili çalışmalar son yıllarda hız kazanmıştır.

Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı’nda planlanan ve Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarı’nda gerçekleştirilen çalışmamızda daha önce hiç üzerinde çalışılmayan intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite üzerine karnosol’un beklenen koruyucu etkisini göstermeyi amaçladık.

Aynı biyolojik ve fizyolojik özelliklere sahip 30 adet Sprague Dawley tek cins rattan rastgele seçimle üç grup oluşturuldu.

Grup 1: Kontrol grubu.

Grup 2: Deney (iskemi-reperfüzyon) grubu. Grup 3: Deney+ilaç (I/R+karnosol) grubu.

Tüm gruplardaki ratlara 7 gün süreyle standart yem ve su verildi. Deney+ilaç grubuna toz halindeki karnosol %10 dimetil sülfoksid (DMSO) ile çözüldükten sonra, operasyondan 3 gün önce başlayarak intraperitoneal yolla 3 mg/kg/gün dozunda verildi. Bütün ratlara ilk operasyondan 12 saat önce orogastrik yolla 1 ml 1010 _{CFU/ml E-coli verildi. 7. günün}

120 dakika süreyle reperfüzyon uygulandı. Karın ön duvarı orta hat insizyonu ile laparatomi yapılarak karın boşluğuna girildi. İnce barsaklar laparotomi kesisinden dışarı çıkarılarak SMA ortaya konuldu. SMA’e atravmatik mikrovasküler bir klemp konulmasıyla dolaşımı engellendi. İntestinal iskemi arter vurumlarının kaybolması ve barsak renginin soluklaşmasıyla doğrulandı. Deney grubuna 0,2 cc DMSO intraperitoneal yolla verildi. İntestinal iskemi sonunda SMA’deki mikrovasküler klemp çıkarılarak intestinal reperfüzyon başlatıldı. Reperfüzyon arter vurumlarının tekrar belirmesi ve ince barsak renginin pembeleşmesi görülerek doğrulandı. Barsaklar tekrar karın içine geri kondu. Laparatomi kesisi atravmatik 4/0 prolen dikişle kapatıldı.

Kontrol grubuna ise orta hat insizyonu ile laparatomi yapılarak karın boşluğuna girildi. 0,2 cc DMSO intraperitoneal yolla verildi. Laparatomi kesisi atravmatik 4/0 prolen dikişle kapatıldı.

72 saat sonra sıçanlara tekrar laparotomi yapılarak mikrobiyolojik, biyokimyasal ve histopatolojik incelemeler için karaciğer, dalak, mezenter lenf nodları ve ileal doku örnekleri ile birlikte deneklerin kan örnekleri sterilizasyon ve dezenfeksiyon şartlarına uyulan laboratuvar ortamında alındı.

2 ml’lik serumda radioimmunoassay kitler yardımıyla ELISA yöntemi kullanılarak TNF-α, IL-1β ve IL-6 ölçümleri yapıldı.

Sonuç:

a) Deney grubunda meydana gelen ileal doku hasarının deney+ilaç grubunda anlamlı düzeyde azaldığı tespit edildi.

b) Deney+ilaç grubunda, karnosol’un vasküler permeabiliteyi azaltmasına rağmen etkisininin anlamlı olmadığı tespit edildi.

c) Deney+ilaç grubunda doku kültürlerinde bakteriyel translokasyon düzeylerinin deney grubuna göre anlamlı bir biçimde azaldığı tespit edildi.

İntestinal iskemi reperfüzyon oluşturulan sıçanlarda kullandığımız karnosol’un iskemi reperfüzyon hasarını önlemedeki etkinliğinin, biyokimyasal, mikrobiyolojik ve histopatolojik değerlendirmeler göz önüne alındığında olumlu olabileceği sonucuna varılmıştır.