İntestinal iskemi-reperfüzyon sonrası oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite üzerine karnosol’un koruyucu etkisinin incelenmesi

1

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

GENEL CERRAHİ

ANABİLİM DALI

İNTESTİNAL İSKEMİ-REPERFÜZYON SONRASI

OLUŞAN BAKTERİYEL TRANSLOKASYON VE

VASKÜLER PERMEABİLİTE ÜZERİNE

KARNOSOL’UN KORUYUCU ETKİSİNİN

İNCELENMESİ

(Uzmanlık Tezi)

Dr. Özgür Cem MÜSRİ

TEŞEKKÜR

Asistanlık eğitimim süresince destek, bilgi ve deneyimlerini esirgemeyen saygıdeğer hocalarım Prof.Dr. Aydın Altan’a, Prof.Dr. Zeki Hoşcoşkun’a, Prof.Dr. İrfan Coşkun’a, Merhum Prof.Dr. Ahmet Rahmi Hatipoğlu’na, Doç.Dr. A. Cem İbiş’e, Doç.Dr. Atakan Sezer’e, Doç.Dr. Tamer Sağıroğlu’na, Yrd.Doç.Dr. Doğan Albayrak’a, hem asistanlık eğitimimde hem tez sürecinde yoğun destek ve ilgisiyle

beni yüreklendiren değerli eğitim ve tez hocam Doç.Dr. Serhat Oğuz’a, tezime yardımcı olan Prof.Dr. Taner Özgürtaş’a, Prof.Dr. Şaban Gürcan’a, Doç.Dr. Tülin Yalta’ya, asistanlık eğitimim süresince pek çok paylaşımda bulunduğum asistan arkadaşlarım ile tüm mesai arkadaşlarıma sonsuz teşekkür ederim. Manevi desteklerini her zaman yanımda hissettiğim hayat arkadaşım Fatma Yalçın Müsri ve sevgili kızım Zeynep Nil Müsri’ye çok değerli babam İbrahim Müsri ve annem Emine Müsri'ye sonsuz teşekkürü borç bilirim.

3

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ

GENEL BİLGİLER

İNTESTİNAL İSKEMİ VE REPERFÜZYON HASARI ... 4

OKSİDANLAR ... 7 ANTİOKSİDANLAR ... 10 BAKTERİYEL TRANSLOKASYON ... 12 VASKÜLER PERMEABİLİTE ... 12 KARNOSOL ... 16

GEREÇ VE YÖNTEMLER

BULGULAR

TARTIŞMA

SONUÇLAR

ÖZET

SUMMARY

KAYNAKLAR

EKLER

SİMGE VE KISALTMALAR

AMP : Adenozin monofosfat

Ang : Anjiyopoetin

ATP : Adenozin trifosfat CCL4 : Karbon tetra klorür

-COOH : Karboksil

COX-2 : Siklooksijenaz-2

DMSO : Dimetil sülfoksid

eNOS : Nitrik oksit sentetaz

GİS : Gastrointestinal sistem

H2O2 : Hidrojen peroksid

HIF : Hipoksinin indüklediği faktör

HO2‾ : Perhidroksil radikali

HOCL : Hipokloröz asit

IL : İnterlökin

I/R : İskemi-Reperfüzyon

II/R : İntestinal İskemi-Reperfüzyon LTB4 :Lökotrien B4

MLN : Mezenter lenf nodları

MRSA : Metisiline dirençli staphilococcua aureus

MPO : Myeloperoksidaz

NF-kB : Nükleer faktör-kappa B

2

O2 : Oksijen

O2− : Süperoksit radikali OH− : Hidroksil radikali ONOO- _{: Peroksinitrit radikali}

PKB : Protein kinaz B

PMNL : Polimorf nüveli lökositler RES : Retikülo endotelial sistem ROO : Peroksil radikali

ROS : Reaktif oksijen türevleri

SMA : Süperior mezenter arter SOD : Superoksit dismutaz SOR : Serbest oksijen radikalleri

Tie : İmmunoglobulin benzeri ve Endotelyal büyüme faktörü (EGF) benzeri bölgeler içeren tirozin kinaz

TNF : Tümör nekrotizan faktör TxA2 : Tromboksan A2

VEGF : Vasküler endotelyal büyüme faktörü XO : Ksantin oksidaz

5-HPETE : 5-hidroperoksieikosatetraenoik asit

GİRİŞ VE AMAÇ

İskemi; dokunun oksijen (O2) ve diğer metabolitlere olan gereksiniminin dolaşım

tarafından sağlanamaması ve bu süreçte oluşan atık ürünlerin yine dolaşım tarafından uzaklaştırılamaması olarak tanımlanır.

İskemi sonrasında hücrelerde pek çok metabolik ve yapısal değişiklikler oluşur. İskemi hücrede oksidatif fosforilasyonu bozarak hücre içi adenozin trifosfat (ATP) ve fosfokreatin sentezinde azalmaya yol açar. Bu durum hücre membranının ATP’ye bağımlı iyonik pompa fonksiyonunu bozarak hücreye daha fazla kalsiyum, sodyum ve su girmesi ile sonuçlanır. İskemi sırasında adenin nükleotitinin yıkımı da artar. Bu durum ise reaktif oksijen türevlerinin (ROS) prekürsörü hipoksantinin hücre içi birikimini artırır. İskemik dokuda kan akımının yeniden sağlanması (reperfüzyon) ve hücre içine moleküler oksijenin yeniden sunulması ile birlikte ROS türevleri hızla oluşmaya başlar. İskemi aynı zamanda endotel hücrelerinde bazı proinflamatuar gen ürünlerinin (lökosit adezyon molekülü, sitokinler vb.) ve bioaktif bileşiklerin (endotelin, tromboksan A2 vb.) sentezini artırırken, bazı koruyucu gen

ürünlerinin (yapısal nitrik oksit sentetaz (e NOS), sikloosijenaz- 2 (COX-2)) ve bu enzimlerin ürünlerinin (nitrik oksit (NO), prostasiklin, adenozin) ekspresyon ve sentezini de baskılar (1, 2) . İskemi sonrası geri dönüşümsüz hücre hasarını önleyebilmek için organa veya dokuya yeniden kan akımının sağlanması gerektiği düşünülürken, reperfüzyonun gerçekleştirilmesi, iskemik dokularda iskeminin dokuda veya organda oluşturduğu hasardan daha fazla bir hasara yol açabilmektedir (3). İskemi ve reperfüzyon periyodlarında oluşan bu zararlı etkilerin tümü iskemi reperfüzyon (I/R) hasarı olarak adlandırılır. I/R herhangi bir organ yada dokuda geliştikten sonra iskeminin süresi, şiddeti ve organın büyüklüğüne bağlı olarak hem o organda hem de uzak organlarda hasar meydana gelir. İlk olarak iskemi sonrası reperfüze edilen organda hücresel bütünlüğün bozulması sonucu ödem ve organ fonksiyon bozukluğu ile

karakterize inflamatuar ve metabolik bir hasar başlar. Olayın şiddetine bağlı olarak hasar hiçbir morfolojik değişikliğin olmadığı durumdan, bariz makroskobik hasarın olduğu bir düzeye kadar değişik derecelerde olabilir. Olay çoğu kez o organda sınırlı kalmayıp aktive olan birçok sistem ve toksik medyatörlerin etkisi ile başta akciğerler olmak üzere karaciğer, dalak, kalp, beyin ve böbrekler gibi uzak organlarda da hasar meydana getirir.

İntestinal iskemi ve reperfüzyon (II/R) genellikle morbidite ve mortalite ile sonuçlanan ciddi bir tablodur (4). İntestinal kan akımında bozukluğa yol açan durumlar oldukça geniş bir spekturuma sahip oldukları için her yaş grubundan hasta II/R riski altındadır.

II/R, aynı zamanda barsağın mukoza engelini bozarak bakterilerin ve endoktoksinlerin sistemik dolaşıma geçmesine de neden olur (5-8). Endotoksin dolaşımdaki monositlerin, akciğer ve karaciğer gibi farklı dokulardaki makrofajların aktivasyonunu tetikler. Aktive olan monosit ve makrofajlardan çeşitli sitokinler ve inflamatuar mediatörler açığa çıkarak sistemik inflamatuar yanıtın ortaya çıkmasına neden olur (5-7, 9). Polimorf nüveli lökositlerin (PMNL) endotel hücresine adezyonu sonrası açığa çıkan toksik maddelerin neticesinde endotelyal tabakada da hasar oluşur, kapiller permeabilite artar, alveolar ve interstisyel ödem gelişir (10).

Yeniden kanlanma ile dokudaki hasar miktarı giderek artar. Bunun en önemli nedeni olarak sitotoksik ajanlar gösterilmektedir (11, 12) .

Deneysel I/R modeli üzerinde antioksidanların etkileri ile ilgili çalışmalar son yıllarda hız kazanmıştır. I/R hasarının önlenmesinde endojen antioksidan sistemler etkili olduğu gibi eksojen antioksidan sistemler de etkilidir. Eksojen antioksidanlar konusunda literatürde çok farklı ilaçlar ve gıdalar üzerinde çalışmalar bulunmaktadır (13, 14).

Biberiye (Rosmarinus officinalis) bitkisiyle de benzer çalışmalar yapılmış antiinflamatuar, antikarsinojenik, antiproliferatif, antimikrobiyal etkilerinin yanı sıra antioksidan özelliklerinin de olduğu gösterilmiştir (15). Antioksidan aktiviteyle ilişkili biberiyede bulunan en önemli fenolik diterpenler; karnosol, carnosik asit ve rosmarinik asittir.

Literatürde karnosol’un antioksidan özelliğinin araştırıldığı çok az sayıda çalışmaya rastlanmıştır. Yapılan bir çalışmada (16) karnosol’un intestinal I/R sonrası karaciğerde meydana gelen biyokimyasal ve histopatolojik değişiklikler üzerine olan etkisi incelenmiş, bir diğer çalışmada (17) ise intestinal I/R sonrası akciğer hasarı üzerine proinflamatuar sitokin olan interlökin-6 (IL-6) downregülasyonu üzerinden yapmış olduğu koruyucu etki değerlendirilmiştir. İntestinal I/R sonrası akciğer ve karaciğer dokusunda meydana gelen hasara karşı etkili bir antioksidan özelliği olan karnosol’un bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite artışı üzerinde koruyucu etkisinin olup olmadığını gösteren bir çalışmaya rastlanmamıştır.

Bu nedenle bu çalışmada deneysel intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite artışı üzerine karnosol’un koruyucu etkisinin olup olmadığını araştırmayı amaçladık.

GENEL BİLGİLER

İNTESTİNAL İSKEMİ VE REPERFÜZYON HASARI

Şok, yanık, sepsis, pankreatit gibi olgularda ortaya çıkan hipovolemi ile iskemik hasar ve bu durumların resüsite edilmesi ile de reperfüzyon hasarı ortaya çıkmaktadır. Serebrovasküler olaylar, myokard infarktüsü ve mezenteriyovasküler olaylar sonrası uygulanan trombolitik tedavi veya revaskülarizasyon ameliyatları da yine reperfüzyon hasarına neden olabilmektedir. Travmalarda ve travma cerrahilerinde hipovolemi yada kanama kontrolü nedeniyle yapılan klemp, tampon uygulamaları da iskemiye neden olurken resüsitasyon sonrası mutlak bir reperfüzyon ile yine I/R hasarı gündeme gelmektedir. Genel olarak bütün cerrahi işlemler sırasında dokuların iskemisi ve sıklıkla bunun takip eden bir repefüzyon periyodu vardır.

İntestinal kan akımında meydana gelen ciddi azalma iskemik hasar ile sonuçlanır. Kan akımı geri döndüğünde ise reperfüzyon hasarı adı verilen ve iskemik hasardan daha şiddetli bir hasar meydana gelir. Reperfüzyon hasarının oluşmasından iki mekanizma sorumlu tutulur. Bunlardan ilki PMNL’ler, myeloperoksidaz (MPO) enzimi ve intestinal mukoza hücrelerindeki ksantin oksidaz (XO) enzimi etkisiyle serbest oksijen radikallerinin açığa çıkmasıdır. Açığa çıkan serbest oksijen radikalleri hücre üzerinde lipid peroksidasyonuna ve diğer zararlı etkilere neden olur. İkincisi ise hidrolitik bir enzim olan fosfolipaz A2’nin

iskemik dönemde artan sitoplazmik kalsiyum etkisiyle aktive olması ve hücre membranlarındaki yağ asidlerini fosfolipidlerden ayırmasıdır (17-21).

Membran hasarının birçok potansiyel nedeni vardır (şekil 1).

1-Membran fosfolipidlerinin ilerleyici kaybı: İskemiye bağlı kalsiyum artışı ile endojen fosfolipazların aktivasyonu membran hasarında artışa yol açabilir.

2- Hücre iskelet anormallikleri: Hücre içi kalsiyumun artması ile aktive olan proteazlar da hücre çatısına zarar verebilirler.

3- Toksik oksijen radikalleri: İndirgenmiş oksijen türevleri hücre membran ve elemanlarına zarar verirler. Toksik oksijen radikalleri iskemik dokularda, özellikle kan akımının yeniden sağlanmasından sonra artar. Toksik oksijen radikallerinin büyük ölçüde reperfüzyon sırasında zedelenme alanına gelen PMNL’ler tarafından oluşturulduğu düşünülmektedir.

4- Lipid yıkım ürünleri: Fosfolipid parçalanması sonucu iskemik hücrelerde biriken katabolik ürünler membranlar üzerinde deterjan etkisi yapar (16).

Membran hasarının mekanizmaları ne olursa olsun sonuç, yukarıda tanımlanan olaylarla kalsiyumun bol miktarda hücre içine girmesi ile ilişkilidir (16).

Şekil 1. İskemide membran hasarının mekanizmaları (16)

Serbest oksijen radikalleri hem dokuya doğrudan zarar vermekte hem de PMNL’lerin hasarlı dokuda birikmesine yol açmaktadır. Dokuya gelen aktive PMNL’lerden myeloperoksidaz, elastaz, proteaz, kollajenaz, laktoferrin ve katyonik proteinler gibi enzimler açığa çıkarlar. Bu enzimler hem dokudaki hasarı arttırır, hem de daha fazla radikal oluşmasına neden olurlar (Şekil 2) (18, 20-22).

İskemik intestinal mukozada nötrofil infiltrasyonun stimüle olduğu ve nötrofil infiltrasyonu sonucunda O2 -, H2O2, OH- gibi serbest oksijen türevlerinin açığa çıkarak doku

hasarına sebep olduğu bilinmektedir.

Şekil 2. Serbest oksijen radikalinin dokudaki doğrudan ve dolaylı etkileri (18)

İntestinal mukoza hücrelerinin membran lipid ve proteinleri hasara uğramazsa hücrelerin normal fonksiyonları devam eder (19).

Araşidonik asit 20 karbonlu poliansatüre bir yağ asididir. Vücutta yalnızca hücre membran proteinlerinin bir komponenti olarak bulunur. Araşidonik asit bu fosfolipidlerden hücresel fosfolipazlar yoluyla salınır. Hücresel fosfolipazlar mekanik, kimyasal, fiziksel uyarı veya C5a gibi iltihabi mediatörlerce aktive edilirler. Daha sonra siklooksijenaz enzimi ile

prostoglandinler ve tromboksan A2 (TxA2) oluşturulur. Nötrofillerde baskın olarak

5- Lipooksijenaz enzimi ile 5-HPETE oluşur. 5-HPETE oldukça kararsızdır; ya nötrofiller için kemotaktik olan 5-HETE’ye veya lökotrienlere dönüşür. Lökotrienlerden de özellikle

LTB4 nötrofiller için kemotaktiktir (16). Oksijen radikallerinin salımı sonucunda intraselüler

kalsiyumda bir artış olur ve bu kalsiyum artışı plazma membran fosfolipaz aktivasyonunu artırarak araşidonik asit metabolizma ürünlerinin açığa çıkmasına neden olur. Bu ürünler nötrofil aracılı I/R hasarını şu üç yoldan biriyle etkiler.

1-Bu ürünlerden özellikle TxA2 ve LTB4 kemo-atraktan etkilidir.

2-Araşidonik asit ürünleri aynı zamanda nötrofil aktivatörleri gibi çalışabilirler. LTB4

nötrofil aracılı artmış kapiller permeabiliteyi in vivo ve in vitro olarak indükleyebilir (23). TxA2’ nin de nötrofillerden hidrojen peroksit yapımını artırdığı bilinmektedir (24).

3-Lökotrienler ve tromboksan mikrovaskülarizasyon düzeyinde kan akımını ve böylelikle direk etkiyle doku perfüzyonunu azaltıcı etkiye sahiptirler. Bu yolla, reperfüzyon esnasında kan akımını daha da yavaşlatırlar (25).

OKSİDANLAR

Serbest oksijen radikalleri hakkındaki bilgiler 1970’lerden sonra ortaya çıkmıştır. 1981’de Granger ve arkadaşları (26) tarafından intestinal iskemi sonrasında reperfüzyonun oksijen radikalleri oluşumuna neden olduğu gösterilmiştir.

Yörüngelerinin en dış orbitasında bir veya daha fazla eşleşmemiş elektron taşıyan atom veya moleküle serbest radikal adı verilir. Son orbitadaki bu eşleşmemiş elektrondan dolayı, bu atom veya molekül reaktif olup diğer moleküller ile kolayca reaksiyona girme eğilimindedir (27-30).

Fizyolojik koşullarda oksijen, dış orbitada iki tane eşleşmemiş elektronu ile önemli bir serbest radikaldir. Ayrıca oksijen ile reaksiyona giren moleküllerin oluşturduğu serbest radikaller de biyolojik sistemde önemli bir yere sahiptir (31).

Serbest radikallerin endojen ve eksojen kaynakları bulunur. Serbest radikaller hücresel metabolizma sırasında sürekli olarak üretilirler. Endojen kaynaklı serbest radikaller, mitokondrial elektron transport zinciri, oksidan enzimler (ksantin oksidaz, siklooksijenaz, vb.), fagositler, nötrofiller, Fe+2 ve epinefrinin hücresel otooksidasyonuna bağlı olarak ortaya çıkarken, eksojen kaynaklılar, okside ilaçlar (CClB4B, asitaminofen), sigara, radyasyon ve

glutatyonu oksidize eden maddeler sonucu ortaya çıkarlar (29).

Normal koşullarda mitokondrial elektron transport sisteminde oksijene dört elektron eklenerek suya indirgenir.

İskemi reperfüzyon hasarı durumunda ise sadece bir elektron (eˉ) transferi ile indirgenme sonucu oldukça reaktif serbest oksijen radikalleri (SOR) meydana gelir. Bunların başında süperoksid anyonu (O2 ‾), hidrojen peroksid (H2O2), hipokloröz asit (HOCl), hidroksil

(OHˉ) radikalleri bulunur. Kaminski ve arkadaşlarının (32) yaptığı çalışmada da gösterildiği gibi serbest oksijen radikalleri en fazla reperfüzyonun ilk birkaç dakikasında üretilir. Bu nedenle de en çok hasar bu dönemde görülür.

Süperoksid anyonu tek başına yıkıma neden olacak reaksiyonları başlatabileceği gibi esas olarak daha reaktif oksijen radikallerinin oluşumuna yol açarak hücre toksisitesinde de rol oynar (33).

Süperoksid Radikali (O2‾)

Oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonrasında oluşan zayıf reaktif bir serbest radikaldir. Nerdeyse tüm aerobik hücrelerin mitokondri iç zarında oluşur.

O2 + e‾ O2‾

Süperoksid kendi başına fazla zarar vermez. Önemli olan, hidrojen peroksid kaynağı olmasıdır. Süperoksid, hidrojen peroksid ile reaksiyona girerek hidroksil radikali ve singlet oksijen oluşturabilir.

O2 ‾ + H2O2 ¹O2 + OHˉ + OH

Süperoksid, hidroksi radikali ile tepkimeye girerek de singlet oksijen oluşumuna neden olur.

O2 ‾ + OHˉ ¹O2 + OHˉ

Süperoksidin, fizyolojik serbest radikal olan nitrik oksit ile birleşmesi sonucu reaktif oksijen türevi olan peroksinitrit meydana gelir.

O2 ‾ + NOˉ ONOOˉ

Peroksinitrit oluşumu sayesinde NOˉ’nun normal etkisi inhibe olur. Ayrıca, peroksinitrit çeşitli toksik ürünlere dönüşerek de proteinlere zarar verir.

Süperoksid, düşük pH değerinde daha reaktif olup oksidan perhidroksil radikali (HO2‾) oluşturmak üzere protonlanır.

Süperoksid anyonu, hem oksidleyici hem de redükleyici özelliğe sahiptir. Redüktan olarak görev yaptığında bir elektron kaybeder ve oksijene okside olur. Oksidan olarak görev yaptığında ise bir elektron alır ve hidrojen perokside indirgenir.

Süperoksid ile perhidroksil radikali reaksiyona girdiğinde biri okside olurken diğeri redükte olur. Sonuçta oksijen ve hidrojen peroksid oluşur (34).

HO2‾ + O2 ‾ + H O2 + H2O2

Hidrojen Peroksid (H2O2)

Oksijenin çevresindeki moleküllerden 2 elektron alması ile indirgenerek veya süperoksidin bir elektron alması ile peroksit oluşur. İkinci yol biyolojik sistemlerde sıklıkla görülür. Peroksit molekülü de 2 hidrojen atomu ile birleşerek hidrojen peroksidi meydana getirir. Hidrojen peroksit, membrandan kolayca geçebilen uzun ömürlü bir oksidandır. Hidrojen peroksit serbest bir radikal olmamakla birlikte kimyasal olarak reaktif olması nedeni ile reaktif oksijen türü olarak kabul edilmektedir (28, 29).

O2‾ + e‾ + 2H + _H 2O2

O2‾ + 2H+ _H

2O2 + O2

Bu tepkimede (dismutaz tepkimesi) süperoksit radikalleri temizlenmiş olur. Bu reaksiyon spontan veya SOD aracılığı ile olabilir. Hidrojen peroksit reaktif bir serbest radikal değildir. Nötrofil fagozomlarında bulunan myeloperoksidaz enzimiyle çok reaktif serbest oksijen radikali olan hipokloröz asit (HOCl) oluşumuna sebep olur.

H + _{+ Cl ‾ + H}

2O2 HOCl + H2O

Hidrojen peroksit geçiş metallerinin varlığında en önemli serbest oksijen radikali olan hidroksil radikalinin (OHˉ) oluşumunu sağlar. H2O2’nin diğer önemli görevi de hücre içi

sinyal molekülü olarak rol almasıdır. H2O2’nin uzaklaştırılmasında da katalaz, glutatyon

peroksidaz ve peroksiredoksin enzimleri görev alır (28).

Hidroksil radikali (OHˉ)

Biyolojik sistemlere diğer SOR’den daha fazla zarar veren ve biyomoleküller ile reaksiyona girebilen güçlü bir radikaldir. Ancak oluşması için ortamda geçiş metalleri ve hidrojen peroksit gereklidir.

Demir (Fe+2) katalizli Haber Weiss reaksiyonu (fenton reaksiyonu) veya katalize olmayan Haber Weiss reaksiyonu (süperoksidin direk olarak hidrojen peroksitle reaksiyona girmesi) ile oluşur.

Fe+2 + H2O2 Fe+3 + OH'+ OHˉ

O2‾ + H2O2 OH' + OHˉ + O2

Hidroksil radikali canlı hücrede bulunan tüm moleküller ile reaksiyona girebilir. Lipid peroksidasyonunu başlatabilir, DNA’da kırılmaya neden olabilir (35).

Singlet oksijen (¹O2):

Serbest oksijen reaksiyonları sonucu meydana gelir. Aynı zamanda serbest oksijen reaksiyonlarının başlamasına da sebep olabilen radikal olmayan moleküldür. Enerji

absorbsiyonu nedeni ile oksijenin paylaşılamamış dış elektronlarını değiştirerek aynı veya farklı orbitale yerleşebilirler. DNA, RNA, protein, lipidler ve sterollerle ile reaksiyona girerek hücreye zarar verirler.

Serbest radikaller oksijen kaynaklı olabildiği gibi karbon kaynaklı da olabilirler. Bu radikaller lipid, nükleik asit, karbonhidrat veya protein gibi moleküllerin yapısında bulunan karboksil (-COOH) gruplarını, oksijen kaynaklı radikallerin harekete geçirmesi ile oluşurlar. Bu reaksiyon sonucunda peroksil radikali (ROO•) meydana gelir. Peroksil radikalleri daha sonra alkoksil radikali oluşturan reaksiyona katılırlar (28, 29, 31).

Serbest radikal türleri ile ilgili ayrıntılı bilgi ayrıca Tablo 1’de verilmiştir.

Tablo 1. Serbest radikal türleri (36)

Radikal Simge Tanımlama

Hidrojen H+ _{Bilinen en basit radikal}

Süperoksit O2‾ Oksijen metabolizmasnın ilk ara ürünü

Hidroksil OH- _{En toksik (reaktif)oksijen metabolit radikali}

Hidrojen peroksit _H2O2 Reaktivitesi en düşük, moleküler hasar düzeyi düşük

Oksijen _O2 Yarılanma ömrü hızlı, güçlü oksidatif oksijen formu

Perhidroksil radikali

HO2-

Lipidlerde hızlı çözünerek lipid peroksidasyonunu artırır.

Peroksil radikali

ROD Perhidroksile oranla daha zayıf etkili, lipidlere lokalize olur

Triklormetil radikali

CCl3- CCl metabolizması ürünü karaciğerde üretilen bir

radikal

Thyl radikali RS

Aldoksil RO

Nitrik oksit NO

Azot dioksit NO2

Serbest radikaller, hücrede DNA, nükleotid, lipid, enzim aktiviteleri ve protein yapısında tahribat yaparken, hücrede steroid ve yaş pigmentlerin birikmesine de neden olurlar. Aynı zamanda mitokondrideki aerobik solunumu ve kapiller permeabiliteyi bozarlar. Hücrenin potasyum kaybını ve trombosit agregasyonunu arttırırlar (28, 29, 32-34).

ANTİOKSİDANLAR

Normal şartlarda da vücutta üretilen serbest radikallerin birçok zararlı etkisi vardır. Bu nedenle organizmayı korumak üzere birçok savunma mekanizması geliştirilmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri olarak bilinirler (34, 36, 37) .

Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek ve/veya reaktif oksijen türlerini toplayarak lipid peroksidasyonunu inhibe ederler. Antioksidanlarla ilgili birçok sınıflama yapılmıştır. Antioksidanlar temel olarak endojen ve ekzojen olmak üzere iki

başlık altında değerlendirilirler. Endojen antioksidanlar enzim olan veya olmayan şeklinde sınıflandırılırlar (27, 34, 38-40).

Endojen Antioksidanlar

Vücudumuzdaki antioksidan savunma sisteminde yer alan başlıca elemanlar; enzimler, metal iyonlarını bağlayan proteinler ve suda ve yağda çözünen radikal tutucularıdır (41). Endojen etkili antioksidanlar Tablo 2’de gösterilmiştir.

Tablo 2. Organizmada bulunan temel antioksidan savunma sistemleri

Enzimler Enzim Olmayanlar

Radikal tutucular Metal iyonları bağlayan

proteinler

Yağda çözünenler Suda çözünenler

*Süperoksit dismutaz *Katalaz *Glutatyon peroksidaz *Glutatyon redüktaz *Glutatyon S transferaz *Glutatyon 6 fosfat dehidrogenaz *E vitamini *Beta karoten *Bilirubin *Ubikinon *Flavonoidler *Melatonin *Lipoik asit *C vitamini *Glutatyon *Ürik asit *Sistein *Mannitol *Ferritin *Transferin *Laktoferrin *Albumin *Seruloplazmin *Miyoglobin Eksojen Antioksidanlar

Eksojen antioksidanlar; vitaminler, ilaçlar ve gıdalarda doğal ve sentetik olarak bulunan antioksidanlar olarak sınıflandırılırlar (31, 34, 41).

İlaç olarak kullanılan eksojen antioksidanlar; ksantin oksidaz inhibitörleri (allopürinol, oksipürinol, pterin aldehit, tungsten), NADPH oksidaz inhibitörleri (adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, nonsteroid antiinflamatuvar ilaçlar, diphenyline iodonium), rekombinant süperoksit dismutaz, trolox-C (vitamin E analoğu), endojen antioksidan aktiviteyi artıranlar (GSH-Px aktivitesini artıran ebselen ve asetilsistein), demir redoks döngüsü inhibitörleri (desferroksamin), nötrofil adezyon inhibitörleri, sitokinler (TNF-α ve IL-1β), barbitüratlar ve demir şelatörleridir.

Gıdalarda birçok ekzojen antioksidan bulunur. Gıdalarda doğal olarak bulunan antioksidanların çeşitli hastalıklara karşı koruyucu etkileri üzerine yapılan birçok çalışma vardır (14, 42-49). Gıdalarda bulunan antioksidanlardan bazıları; Karnosol, askorbik asit, α-tokoferol, β- karotenoidler, glutatyon, fitosteroller, flavonoidler, kumarinler, fenolik asitler, selenyum ve izotiyosiyanatlardır.

BAKTERİYEL TRANSLOKASYON

Bakteriyel translokasyon intestinal lümendeki canlı bakteri ve/veya bakteri ürünlerinin bağırsak bariyerini geçerek lenf düğümleri, karaciğer, dalak ve kan dolaşımına geçtiği durum olarak tanımlanır. Normal koşullarda bağırsak mukozası mikrofloraya karşı karmaşık bir bariyer sistemine sahiptir. Bazı patolojik durumlarda diğer sistemik organlara gastrointestinal lümenden bakteri ve bakteri ürünleri geçişi meydana gelir. Bu sürece bakteriyel translokasyon denir (50).

Günümüzde gastrointestinal sistemin (GİS) sadece besin emilimini sağlayan basit bir sistem olmadığı anlaşılmıştır. GİS, kişi ile dış ortam arasındaki en geniş ara yüzdür ve önemli metabolik, endokrin, immünolojik ve bariyer fonksiyonlarına sahiptir (51). GİS mukozası seçici geçirgenlik özelliği ile besinlerin emilimine müsaade ederken, mikroorganizmalar ve lümen antijenleri başta olmak üzere intralüminal zararlı etkenlerin geçişini engeller. Bu fonksiyonuna intestinal bariyer fonksiyonu adı verilir. İntestinal bariyer fonsiyonu; sekretuar immünglobulin A (Ig A), intramukozal lenfositler, payer plakları, MLN, retiküloendotelyal sistem (RES) hücreleri ve intestinal epitelyum hücrelerinden oluşan mekanik bir bariyer fonksiyonudur (52).

Normal şartlarda ince barsaklar çok az bakteri içerirler, ancak iskemide bakteriler hızla çoğalırlar. İnce barsak iskemisinin ilerlemesiyle barsak duvarının (intestinal mukoza) bakterilere karşı bariyer özelliğini kaybetmeye başlaması, bakteriyel translokasyonla sonuçlanır (53-55).

VASKÜLER PERMEABİLİTE

Anjiyogenez; önceden var olan kan damarlarından yeni kan damarlarının oluşması sürecidir. Damarların iç tabakasını oluşturan endotel hücrelerine etki eden birçok sinyal anjiyogenezisi tetikler. Endotel hücreleri kan damarlarının fonksiyonlarını düzenleyen perisitler tarafından çevrelenirler. Damar endoteli plazma ve hücrelerin kan dolaşımından dokulara geçişini kontrol eden sıkı bir bariyer oluşturur (56). Bariyer fonksiyonunun endotel hücreler tarafından düzenlenmesi, kan damarlarının oluşması ve inflamatuar yanıtın gerçekleşmesi için kompleks sinyal yolaklarının koordineli olarak çalışması gerekir.

İnflamasyona yanıt olarak bazı sitokinler ve mediatörler ile uyarılar sonrasında aktive olan endotel hücrelerinden saniyeler veya dakikalar içinde önceden sentezlenmiş ve depolanmış olan von-willebrand factor, P-selectin, CD63, IL-8, endotelin-1, doku plasminojen aktivatorü ve anjiyopoetinler gibi moleküller salınır. Bu moleküllerin hepsi hızlı

endotel yanıtı, hemostaz, inflamasyon, hemodinamik adaptasyon ve damar geçirgenliğinin kontrolünde rol alır.

İnflamasyon ve anjiyogenezin birbirini etkilediği bilinmektedir ancak bu ilişkinin nasıl olduğu henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Damar endotel hücreleri dokudaki uyarılara göre anjiyogenez ve/veya inflamasyon ile yanıt verirler. Anjiyogenezde görev alan Ang-2’nin aynı zamanda inflamatuar yanıtı artırması anjiyogenezin ve inflamasyonun ortak mekanizmaları içerdiğini desteklemektedir. Ayrıca anjiyogenezi düzenleyen tirozin kinaz reseptörleri inflamasyon sırasında endotel hücre yanıtını kontrol ederler. Endotel hücre homeostazını sağlamada Ang – immunoglobulin benzeri ve EGF benzeri bölgeler içeren tirozin kinaz (Tie) sistemi anahtar role sahiptir. Anjiyopoetin - Tie reseptör sistemi iki tirozin kinaz reseptörü (Tie-1 ve 2) ve dört ilgili ligandan (Ang-1,2,3 ve 4) oluşmaktadır (Şekil 3).

Şekil 3. Ang-1 ve Ang-2 ile Tie-2 reseptör etkileşimi, damar denge durumunun düzenlenmesi (57)

Tie-1 ve Tie-2 reseptörlerinin ekstraselüler kısımları %33 benzerlik gösterirken intraselüler tirozin kinaz kısmı %76 benzerlik gösterir (57). Angiopoetinler öncelikle Tie-2 reseptörü ligandları olarak tanımlanmıştır. Hem Ang-1 hem de Ang-2 Tie-2’nin ekstraselüler kısmındaki aynı bölgeye benzer afinitelerle bağlanır.

ANJİYOPOETİN 1 VE 2

Kan damarı oluşumunun ana düzenleyicileri anjiyopoetinlerdir. Anjiyopoetinler damar oluşumu ve remodellingde rol oynayan büyüme faktörleri ailesinde yer alır. Anjiyogenezde rol almaları yanında inflamatuar yanıtı da düzenlemektedirler.

Anjiyopoetinler arasında en iyi tanımlananlar Ang-1 ve Ang-2’dir. Özellikle perisitlerden Ang-1, endotel hücrelerinden Ang-2 salgılanmaktadır (58).

Anjiyopoetin-1 Tie-2 reseptör agonisti olup damar yapısının ve fonksiyonlarının korunmasıyla birlikte anti-apoptotik ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Lökositlerin endotele adezyonu ve endotelden geçişi, sitokin üretimi, adezyon molekül salınımını ve damar permeabilitesini inhibe etmektedir (59-61). Ang-1 NF-ĸB aktivasyonunu inhibe ederek inflamatuar sitokin üretiminin azalmasını sağlar ve inflamatuar bir sitokin olan TNF-α’nın etkisine ters yönde etki eder. Ang-1 düşük TNF-α düzeylerinde kontrolsüz bir inflamatuar yanıtı engeller (62). Ang-1 aracılı PKB-Akt sinyali direk olarak endotel hücre apoptozunu önler ve Ang-2 salınmasını önleyerek endotel aktivasyonunu engellemektedir.

Tie-2 fosforilasyonu, anti-apoptotik ve endotel hücresinin durağan durumunun devamlılığını sağlar. Endotel hücresi üzerinde koruyucu etkisi olan Ang-1 hücrenin sitokinlerce aktive olabilme özelliğini kısıtlar. Ang-1 damarları adeta mühürler, inflamasyonu engeller ve damarların denge durumunun korunmasını sağlar. Bunların ötesinde Ang-1, Vascular endothelial growth factor (VEGF)’nin uyardığı kan damar oluşumu ve adezyon molekül ekspresyonunu da engeller (63, 64). İnterlökin-1β ve TNF-α’nın insan endotel hücrelerinde Ang-1 mRNA salınımını azalttığı saptanmıştır (65, 66).

Anjiyopoetin-2 ise tam ters etkilere neden olur. Ang-1’in aksine Ang-2, Tie-2 reseptörlerinde fosforilasyon yapmaz ve bu reseptörü inhibe ederek vasküler denge halini bozar. Böylece Ang-1’in damarları stabilize edici ve olgunlaştırıcı etkisi ortadan kalkar. Ang-2 endotel hücre ile damar çevresindeki destek hücreleri ve ekstraselüler matriks arasındaki bağları gevşeterek mikrovasküler permeabiliteyi arttırır. Etkisi lökosit adezyon basamağında başlar, endoteli aktive ederek ve endotel geçirgenliğini arttırarak inflamatuar yanıtı güçlendirir.

Ang-2 inflamatuar yanıtı tetiklerken endotel dengesini bozar ve endotelin dış etkilere duyarlı hale gelmesine neden olur. Endotel dengesinin bozulması endoteli özellikle sitokinlere karşı duyarlı hale getirir. VEGF gibi anjiyogenik, TNF-α ve IL-1β gibi inflamatuar sitokinlerin aktivitelerini kolaylaştırır (67,68). Farklı endotelyotropik sitokinler (Fibroblast GF-2, VEGF ve TNF-α) ve çevresel faktörler (hipoksi, yüksek glikoz seviyeleri ve süperoksitler) tarafından Ang-2 salınımı uyarılmaktadır (67-72).

Aynı zamanda Ang-2, damar stabilizasyonunun bozulmasıyla birlikte hypoxia inducing factor (HIF) -1 transkripsiyon faktörünü de aktive ederek hipoksiye neden olur. Hipoksi ise Ang-1 ekspresyonunu engeller.

Güçlü TNF-α düzeyinin Ang-2 varlığında Ang-1’in etkisini azalttığı gösterilmiştir (68). Ang-1’in anti-inflamatuar etkisinin kaybolması antagonist Ang-2 üzerinden dolaylı olarak oluşmaktadır. Endotelde Ang-2 üretimini ve sekresyonunu TNF-α’nın uyardığı düşünülmektedir. Ang-2’nin kompetetif olarak Tie-2 reseptörüne bağlanması Ang-1’in anti-inflamatuar fonksiyonlarını engeller ve endoteli TNF-α sinyaline karşı duyarlı hale getirir (Şekil 4) (73).

Şekil 4. Ang-1, Ang-2, TNF-α’nın inflamasyon ve anjiyogenezde koordine çalışması, ilgili reseptör ve yolaklar üzerine etkileri (73)

Ang-2 endotel hücre adezyon molekül ekpresyonunu direk olarak etkilemez ancak iskemi ve benzeri olaylar sonrası ortaya çıkan inflamatuar sitokinlere karşı dinlenme halindeki endoteli daha duyarlı hale getirerek vasküler permeabiliteyi artırır (68, 74). Dengeli bir Ang-1/Ang-2 oranı damarların fonksiyonel durumunu belirlemektedir. Ang-1/Ang-2 oranı Ang-1 lehine olduğunda Ang-2 üretimi azalmaktadır. Ancak endotel hücre aktivasyonu sonrası Ang-2 salınır ve Ang-2 trankripsiyonunda artış olur. Bu oran lokal olarak Ang-2 lehine kayar. Bu olayı takiben Ang-2’nin neden olduğu Ang-1-Tie sinyali üzerindeki negatif

etki ile endotelin denge durumu bozulur ve endotelin diğer sitokinlere karşı duyarlı hale gelmesine neden olur. Başka uyarı yoksa endotel dinlenme durumuna geri döner. İnflamatuar yanıt ve anjiyogenez, VEGF veya TNF-α varlığında uyarılır ve Ang-2 salınımının daha da artmasına neden olur (68). Ang-2’nin VEGF varlığında anjiogenezi uyardığı ancak VEGF gibi ekzojen uyarılar ortamda yok ise Ang-2 artışı vasküler dengenin bozulmasına ve damar regresyonuna neden olabilir (75).

KARNOSOL

Akdeniz bölgesinde yaşayan ve akdeniz diyetiyle beslenen insanlarda akciğer kanseri oranlarının düşük olduğu saptanmıştır (76, 77). Akdeniz diyetindeki bitkilerden biri de biberiye (Rosmarinus officinalis)’dir. Antioksidan aktiviteyle ilişkili biberiyede bulunan en önemli fenolik diterpenler; karnosol, carnosik asit ve rosmarinik asittir. Karnosol ve carnosik asit biberiye bitkisinde doğal olarak bulunan fenolik diterpene türevleridir. Karnosol, carnosik asitin oksitlenmiş ürünü olup çok güçlü antioksidan, antiinflamatuar, antimikrobiyal ve antikarsinojen özelliklere sahiptir (78-80).

Literatür çalışmalarında karnosol’un sitoprotektif mekanizmaları indükleyerek özellikle TNF-α ekspresyonunu inhibe ederek güçlü bir antioksidan ve antiinflamatuar ajan olduğu gösterilmiştir (78, 81-83).

Tian ve arkadaşları (84) ise yaptıkları deneysel akciğer iskemi reperfüzyon modelinde karnosol’un inflamasyon ve lipid peroksidaz ürünlerinin üretimini azaltarak ve NF-kB aktivasyonunu inhibe ederek antiinflamatuar etki gösterdiğini belirtmişlerdir.

Yapılan bazı çalışmalarda da karnosol’un antibakteriyel etkileri incelenmiş neticede karnosol’un gram (+) bakterilere gram (–) bakterilerden daha etkili olduğu bildirilmiştir (85, 86).

Literatür taramasında karnosol’un bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite artışı üzerinde koruyucu etkisinin olup olmadığını gösteren bir çalışmaya rastlanmamıştır.

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Çalışmamız Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi 26/09/2012 tarih ve 07 sayılı Etik Kurulu onayı ile izin alındıktan sonra gerçekleştirilmiştir (Ek 1). Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Fonu tarafından da desteklenmiştir (Proje No: TÜBAP-2013/19) (Ek 2).

Çalışma Sağlık Araştırmaları Ulusal Topluluğunun yayınladığı “Laboratuar Hayvanları Bakım Prensipleri” ile Laboratuar Hayvan Kaynakları Enstitüsü ile Ulusal Sağlık Enstitüsünün yayınladığı, “Laboratuar Hayvanlarının Bakım ve Kullanım Kılavuzu” (87) doğrultusunda, başta Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Birimi olmak üzere Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Patoloji Anabilim Dalları, ile Gülhane Askeri Tıp Akademisi Biyokimya Anabilim Dalı’nda gerçekleştirildi.

Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Birimi’nde üretilmiş ve standart laboratuar koşullarında (22±1 0_{C, 12 saat aydınlık/karanlık siklusunda) tutulan, aynı biyolojik}

ve fizyolojik özelliklere sahip, ağırlıkları 200-250 gram arasında değişen erişkin 30 adet Sprague Dawley tek cins ratlardan rastgele seçimle üç grup oluşturuldu.

ÇALIŞMA GRUPLARI

1- Kontrol grubu (K) (n= 10) Operasyon günü laparotomi sonrası Superior Mezenter Arteri (SMA) ortaya konan ancak İskemi/Reperfüzyon yapılmayan, intraperitoneal eşit ölçüde DMSO uygulanan grup.

2- Deney grubu (I/R) (n= 10) Operasyon günü laparatomi sonrası intraperitoneal eşit ölçüde DMSO uygulanan, 60 dakika SMA bağlanan ve 2 saat reperfüze edilen grup. 3- Deney+ilaç grubu (I/R+C) (n= 10) Operasyon günü laparatomi sonrası intraperitoneal

DENEKLERİN HAZIRLANMASI

Tüm gruplardaki ratlara 7 gün süreyle standart yem ve su verildi. I/R+C Grubundaki ratlara toz halindeki karnosol (%100 toz halinde karnosol; Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA) %10 dimetil sülfoksid (DMSO) ile çözüldükten sonra, operasyondan 3 gün önce başlayarak intraperitoneal olarak 3 mg/kg/gün dozunda verildi. Operasyon esnasında midenin boş olması amaçlandığından sıçanlar bir gün öncesinden aç bırakıldı. Bütün ratlara ilk operasyondan 12 saat önce orogastrik yolla 1 ml 1010 CFU/ml E-coli verildi. Deneklerin anestezisinde 30 mg/kg dozda ketamine hydrochloride (Ketalar flk; Pfizer Ilaclari Ltd.Sti, İstanbul, Türkiye) ve 3 mg/kg dozda xylazine hydrochloride (Rompun; Bayer, Türk Kimya San.Ltd.Sti. İstanbul, Türkiye) intramusküler enjeksiyon yoluyla kullanıldı (Şekil 5). Sıçanlar ısıtıcı lamba altında supin pozisyonunda masaya yatırıldı (Şekil 6). Karın bölgesi tıraşlanıp %10 povidone iodine solüsyonu (Merkez San. Ltd. Sti. İstanbul, Türkiye) ile uygun sterilizasyonu sağlandı.

Şekil 5. İntramusküler ketamine hydrochloride ve xylazine hydrochloride enjeksiyonu ile anestezinin sağlanması

Şekil 6. Ratlara cerrahi işlem öncesi supin pozisyonu verilmesi İNTESTİNAL İSKEMİ REPERFÜZYON TEKNİĞİ

Bu çalışmada deney grubu ve deney+ilaç grubuna 60 dakika intestinal iskemi ve 120 dakika reperfüzyon uygulandı. Karın ön duvarı cildinin traş edilmesi ve % 10′ luk povidon - iyot solüsyonu ile temizlenmesini takiben orta hat insizyonu ile laparatomi yapılarak karın boşluğuna girildi (Şekil 7). İnce barsaklar laparotomi kesisinden dışarı çıkarılarak SMA ortaya konuldu. SMA’e atravmatik mikrovasküler bir klemp konulmasıyla dolaşımı engellendi (Şekil 8). İntestinal iskemi arter vurumlarının kaybolması ve barsak renginin soluklaşmasıyla doğrulandı (Şekil 9). Barsaklar batın içerisine geri gönderildi. Bu esnada Deney grubuna 0,2 cc DMSO, Deney+İlaç grubuna da 3mg/kg karnosol intraperitoneal olarak verildi. Batın içine sıvı kaybını önlemek için Serum fizyolojk ile ıslatılmış spançlar konularak iskemi süresinin dolması beklendi. 60 dakika sonunda SMA’deki mikrovasküler klemp çıkarılarak intestinal reperfüzyon başlatıldı. Reperfüzyon, arter vurumlarının tekrar belirmesi ve ince barsak renginin pembeleşmesinin görülmesiyle doğrulandı (Şekil 10). Barsaklar tekrar karın içine geri kondu. Laparatomi kesisi atravmatik 4/0 prolen dikişle kapatıldı. Kontrol grubuna ise orta hat insizyonu ile laparatomi yapılarak karın boşluğuna girildi ve sadece 0,2 cc DMSO intraperitoneal olarak verildi. Laparatomi kesisi atravmatik 4/0 prolen dikişle kapatıldı.

72 saat sonra sıçanlara tekrar laparotomi yapılarak mikrobiyolojik, biyokimyasal ve histopatolojik incelemeler için karaciğer, dalak, mezenter lenf nodları ve ileal doku örnekleri ile birlikte deneklerin intrakardiyak ponksiyonla 5 cc kan örnekleri sterilizasyon ve dezenfeksiyon şartlarına uyulan laboratuvar ortamında alındı.

2 ml’lik serumda radioimmunoassay kitler yardımıyla ELISA yöntemi kullanılarak TNF-α, IL-1β ve IL-6 ölçümü yapıldı.

İleal doku örneklerinin yarısı %10’luk formaldehit içinde tespit edildi. Diğer yarısı ise ELISA yöntemiyle intestinal Ang-1 ve Ang-2 düzeylerine bakmak için tampon fosfat solüsyonu içerisinde -80 °C’de saklandı.

Şekil 7. Laparatomi yapılarak karın boşluğuna girilmesi

Şekil 9. İskemi sonrası barsak renginin soluklaşması

MİKROBİYOLOJİK İNCELEME

Kalp ponksiyonu ile alınan 5 ml kan örneklerinde öncelik kontaminasyonu önlemek amacıyla kan kültürüne verildi. Alınan kan örnekleri aerob, anaerob kültür şişelerine konuldu ve yaklaşık 2 ml’si biyokimyasal analiz için ayrıldı. Kan kültürü için alınan örnekler Bact/Alert (Biomerieux, Fransa) kan kültürü cihazında en fazla yedi gün süreyle inkübe edildi. Üreme sinyali alındığı zaman, uygun aerobik ve anaerobik ortama transfer edildi ve 37ºC sıcaklıkta bekletildi. Üreyen bakteriler besiyerlerinde konvansiyonel yöntem ile isimlendirildi ve VITEK2 (Biomerieux, Fransa) otomatik tanımlama sistemi ile tanımlandı.

Doku örnekleri (MLN, Karaciğer ve Dalak) steril koşullarda çıkarıldı ve yaklaşık 1 gr doku steril havanda toz haline getirildi. Daha sonra bu dokulara 1 ml tiyoglukonat eklendi ve homojenize edildi. Bu homojenattan 0.01 ml alınarak uygun besiyerine ekildi. Dokular aerobik ve anaerobik besiyerlerinde 72 saat 37ºC sıcaklıkta bekletildi. Üreyen koloniler sayıldı ve dokudaki bakteri yoğunluğu CFU/gram olarak hesaplandı. Üreyen bakteriler konvansiyonel yöntemler ve VITEK2 (Biomerieux, Fransa) otomatik tanımlama sistemi ile tanımlandılar.

HİSTOPATOLOJİK İNCELEMELER

İleal doku örneklerindeki histopatolojik incelemeler Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda gerçekleştirildi.

Histopatolojik inceleme için alınan ileal doku parçası %10 formaldehitle fikse edilerek daha sonra alkol ile dehidrate edildikten sonra parafin bloklara gömüldü. Işık mikroskobisinde inceleme yapılması için parafin bloklardan ince kesitler elde edildikten sonra bu kesitler hemotoksilen-eozin boyasıyla boyanarak histolojik değişiklikler kantitatif olarak değerlendirildi. Terminal ileumda meydana gelen doku hasar derecesi Chiu klasifikasyonuna göre yapıldı. Chiu klasifikasyonuna göre;

Level 0: Mukozada hasar yok. Level 1: İyi korunmuş vilüsler, sellüler lizis yada inflamatuar proçez yok ancak Grunhagen'in subepitelyal boşlukları mevcut. Level 2: Sellüler lizis yanında Grunhagen'in subepitelyal boşlukları mevcut ve villüsler arasında artmış boşluklar mevcut. Level 3: serbest villüs kesimlerinde tahribat ve inflame hücreler ile dilate damarların varlığı söz konusu. Level 4: Villüslerde yapısal hasarlar, bazal glandüler ülserasyon ve hemoraji ile birlikte nekrotik materyal ve inflame hücrelerin varlığı söz konusu. Level 5: tüm mukozada hasar, glandüler yapıların görülememesi sadece submukozal dokuda şekilsiz materyallerin varlığı söz konusu.

İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME

İstatistiksel değerlendirme, SPSS istatistik programı kullanılarak yapıldı. Ölçülebilen verilerin normal dağılıma uygunlukları tek örnek Kolmogorov Smirnov testi ile bakıldıktan sonra normal dağılım gösterenler için gruplar arası kıyaslamalarda varyans analizi (ANOVA) ve post-hoc Dunnett T3 ve Bonferroni testi, normal dağılım göstermeyenler için Kruskal-Wallis varyans analizi ve Mann Whitney U testi kullanıldı. Tanımlayıcı istatistikler olarak Median (min-max) değerleri ve aritmetik ortalama ± standart sapma verildi. Mann Whitney U testi istatistikler için anlamlılık sınırı p<0.008 kabul edildi

.

BULGULAR

BİYOKİMYASAL İNCELEME SONUÇLARI

Serum TNF-α, IL-1β, IL-6 sonuçları Tablo 3’te gösterilmiştir.

Tablo 3. Serum TNF-α, IL-1β, IL-6 sonuçları

Serumlar K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p TNF-α (pg/mL) 0,88+0,27 1,18+0,19 0,88+0,24 0,013* IL-1β (pg/mL) 23,82+7,01 34,47+10,49 21,61+7,53 0,005* IL-6 (ng/L) 131,82+8,48 143,43+11,64 132,22+10,44 0,028*

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup;

Gruplar serum TNF-α sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark olduğu bulundu (p=0,013). Serum TNF-α sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken deney+ilaç grubunda serum TNF-α sonuçlarının deney grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu (p=0,026) (Şekil 11).

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup.

Şekil 11. Serum TNF-α sonuçları

Gruplar serum IL-1β sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark olduğu bulundu (p=0,005). Serum IL-1β sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken deney+ilaç grubunda serum IL-1β sonuçlarının deney grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu (p=0,006) (Şekil 12).

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup.

Gruplar serum IL-6 sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark olduğu bulundu (p=0,028). Serum IL-6 sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken deney+ilaç grubunda serum IL-6 sonuçlarının deney grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu (p=0,045) (Şekil 13).

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup.

Şekil 13. Serum IL-6 sonuçları

Doku Ang-1 ve Ang-2 sonuçları Tablo 4’te gösterilmiştir.

Tablo 4. Dokularda gram protein başına düşen Ang-1 ve Ang-2 sonuçları

Dokular K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p Ang-1 (pg/g protein) 4,81+2,70 3,18+1,73 5,58+4,41 0,237 Ang-2 (pg/g protein) 126,51+79,18 217,37+163,94 164,18+115,77 0,278

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup.

Gruplar doku Ang-1 ve Ang-2 sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark bulunmadı (sırasıyla p=0,237; p=0,278) (Şekil 14-15).

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup.

MİKROBİYOLOJİK İNCELEME SONUÇLARI

Tablo 5. Grupların kan kültür sonuçlarının değerlendirmesi

Kan kültürü K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p Üreme Yok %100 (n=10) %100 (n=10) %100 (n=10) 1,000 Üreme Var 0 0 0

K: Kontrol grubu; I/R: deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup.

Grupların kan kültürü sonuçlarının değerlendirmesi Tablo 5’de gösterilmiştir. Kan kültürlerinde aerobik ve anaerobik üremeye rastlanmadı. Gruplar kan kültürü sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark bulunmadı (p=1,000).

Doku kültürlerinde anaerobik üreme olmadı. Karaciğer, dalak ve mezenterik lenf nodları örneklerinde meydana gelen aerobik üreme sonuçları aşağıda belirtilmiştir.

Tablo 6. Grupların karaciğer kültürü değerlendirmesi

Karaciğer kültürü K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p Üreme Yok %100 (n=10) %60 (n=6) %100 (n=10) 0,006* Üreme Var 0 %40 (n=4) 0

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup.

Grupların karaciğer kültürü sonuçlarının değerlendirmesi Tablo 6’da gösterilmiştir. Gruplar karaciğer kültürü sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark bulundu (p=0,006). Bu farkın kontrol grubu ile deney grubu arasında (p=0,029) ve deney grubu ile deney+ilaç grubu arasında (p=0,029) olduğu görüldü.

Tablo 7. Grupların dalak kültürü değerlendirmesi

Dalak kültürü K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p Üreme Yok %100 (n=10) %50 (n=5) %100 (n=10) 0,001* Üreme Var 0 %50 (n=5) 0

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: Deney+ilaç uygulanan grup;

Grupların dalak kültürü değerlendirmesi Tablo 7’de gösterilmiştir. Gruplar dalak kültürü sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark bulundu (p=0,012). Bu farkın kontrol grubu ile deney grubu arasında (p=0,029) ve deney grubu ile deney+ilaç grubu arasında (p=0,029) olduğu görüldü.

Tablo 8. Grupların mezenter kültürü değerlendirmesi Mezenter kültürü K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p Üreme Yok %100 (n=10) %60 (n=6) %100 (n=10) 0,006* Üreme Var 0 %40 (n=4) 0

K: Kontrol grubu; I/R: deney grubu; I/R+C: deney+ilaç uygulanan grup;

Grupların mezenter kültürü değerlendirmesi Tablo 8’de gösterilmiştir. Gruplar mezenter kültürü sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark bulundu (p=0,006). Bu farkın kontrol grubu ile deney grubu arasında (p=0,029) ve deney grubu ile deney+ilaç grubu arasında (p=0,029) olduğu görüldü.

HİSTOPATOLOJİK BULGULAR

Deneysel çalışma sonunda gruplardaki deneklerin ince bağırsaklarında oluşan hasarların histopatolojik sonuçları Tablo 9’da gösterildi.

Tablo 9. Grupların patolojik değerlendirmesi

Patoloji (Chiu Klasifikasyonuna göre) K (n=10) I/R (n=10) I/R + C (n=10) p Level 0 %100 (n=10) 0 0 0,000* Level 1 0 0 %70 (n=7) Level 2 0 0 %30 (n=3) Level 3 0 0 0 Level 4 0 %100 (n=10) 0 Level 5 0 0 0

K: Kontrol grubu; I/R: Deney grubu; I/R+C: deney+ilaç uygulanan grup.

Grupların patolojik değerlendirmesi Tablo 9’da gösterilmiştir. Gruplar patoloji sonuçları açısından istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında gruplar arasında anlamlı fark bulundu (p<0,001). Bu farkın kontrol grubu ile deney grubu (p<0,001) ve deney+ilaç grubu (p<0,001) arasında, deney grubu ile deney+ilaç grubu arasında (p<0,001) olduğu görüldü (Şekil 16-17-18).

Şekil 16. Kontrol grubunda Level 0 görüntüsü. (HE, X100)

TARTIŞMA

Bir organa gelen kan akımının çeşitli nedenlerle kesilmesine iskemi denir (10, 88). Reperfüzyon ise dokunun kanlanmasının yeniden başlamasıdır. Serbest oksijen radikallerinin salınımı doku reperfüzyonu esnasında, kandaki oksijen konsantrasyonunun hızlı artışına bağlıdır. Sağlıklı bir kişide vücutta oksidan ve antioksidan düzeyleri denge halindedir (33, 89).

Oluşan serbest oksijen radikalleri çeşitli hücresel savunma mekanizmalarıyla enzimatik veya nonenzimatik yol ile zararsız duruma getirilirler. İskemi reperfüzyon modellerinde çeşitli bitkisel kaynaklı eksojen antioksidanlar kullanılmaktadır (14, 43, 45, 90).

Organlarda sadece iskemi sonrasında değil, reperfüzyon sonrasında da oluşan hasara bağlı fonksiyon bozuklukları görülür. Son yıllarda, iskemik hasara bağlı mukozal lezyonların gelişiminde iki mekanizma üzerinde durulmaktadır. Bunlar, oksijen radikallerinin dengesiz artışı ve iskemi sırasındaki fosfolipaz A2’nin aktivasyonudur. Hücre membranının oksijen

radikalleri ile reaksiyonu sonucu lipid peroksidasyonu ile birlikte hücre ölümü başlar. Antioksidan ajanların kullanımının, bağırsak I/R hasarını azalttığını gösteren çalışmalar mevcuttur. (91).

Karnosol biberiye bitkisinde (Rosmarinus officinalis) bol bulunan fenolik yapıda bir moleküldür. Antioksidan olduğu uzun yıllardır bilinen biberiyenin bu antioksidan özelliğinin %90’ı içeriğinde bulunan karnosol’a aittir.

Literatür taramalarında barsak iskemi reperfüzyonun sebep olduğu akciğer (92), karaciğer (82, 93), renal (90, 94) hasar modellerinde karnosol’un antioksidan, antiinflamatuar ve antikanser etkileri üzerinde durulmuştur.

Bizde çalışmamızda deneysel intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası kan, karaciğer, dalak ve mezenter kültürlerinde oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite artışı üzerine biberiye “Rosemarinus officinalis” ekstresi olan karnosol’un koruyucu etkisinin olup olmadığını araştırmayı amaçladık.

Bir inflamatuar sitokin olan Tümör nekrotizan faktör-alfa (TNF-α)’nın oksidatif stres oluşturarak karaciğer hücre hasarına neden olduğu bildirilmektedir. TNF-α’yı harekete geçiren mekanizmanın NF-KB sinyal yolları olduğu gösterilmektedir (95, 96).

Tsai ve arkadaşlarının (97) inflamasyonun önlenmesinde karnosol’un TNF-α düzeyine etkisini araştırdıkları in vitro çalışmada; karnosol verilen grupta TNF-α düzeyindeki artışın baskılandığı bildirilmiştir.

Mengoni ve arkadaşları (98) ise farklı biberiye ekstrelerininin uygulandığı ratlarda yapmış oldukları çalışmada inflamasyonun engellenmesinde karnosol’un diğer ekstrelere göre daha etkili olduğunu, daha düşük dozlarda bile TNF-α değerlerini düşürdüğünü bildirmişlerdir.

Yapılan birkaç deneysel çalışmada da karnosol’un sitoprotektif mekanizmaları indükleyerek özellikle TNF-α ekspresyonunu inhibe ederek güçlü bir antiinflamatuar ajan olduğu gösterilmiştir (78, 81-83) .

Bizim çalışmamızda ise serum TNF-α sonuçları açısından gruplar karşılaştırıldığında kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken, serum TNF-α sonuçlarının, hem kontrol grubuna hem de karnosol uygulanan grupta iskemi-reperfüzyon oluşturulan gruba göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu. Buna göre literatürle uyumlu olarak karnosol’un güçlü antiinflamatuar etkisinin olduğunu gördük.

Bir diğer proinflamatuar faktör ise IL-6’dır. Tian ve ark. (92) ile Yao ve ark. (93)’nın yaptıkları deneysel çalışmalarda karnosol’un lökositlerin aktive olmasını sağlayan proinflamatuar faktör IL-6 düzeylerinde azalmaya yol açtığı gösterilmiştir.

Bizim çalışmamızda ise serum IL-6 sonuçları açısından gruplar karşılaştırıldığında kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmazken, serum IL-6 sonuçlarının, hem kontrol grubunda hem de karnosol uygulanan grupta iskemi-reperfüzyon oluşturulan gruba göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu. Karnosol, TNF-α gibi IL-6 düzeylerinde de istatistiksel olarak anlamlı azalmaya yol açmıştır.

Tsai ve arkadaşları (97) ratlarda yaptıkları çalışmada inflamasyonun önlenmesinde karnosol’un bir başka inflamatuar sitokin olan IL-1β düzeyine etkisini araştırmışlar, karnosol verilen grupta IL-1β düzeyindeki artışın baskılandığı bildirmişlerdir.

Mengoni ve arkadaşları (98) ise farklı biberiye ekstreleri uyguladıkları ratlarda inflamasyonun engellenmesinde karnasolün diğer ekstrelere göre daha etkili olduğunu, daha düşük dozlarda bile IL-1β değerlerini düşürdüğünü bildirmişlerdir.

Bizim çalışmamızda ise serum IL-1β sonuçları açısından gruplar karşılaştırıldığında kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken, serum IL-1β sonuçlarının, hem kontrol grubuna hem de karnosol uygulanan grupta iskemi-reperfüzyon oluşturulan gruba göre anlamlı derecede düşük olduğu bulundu. Çalışmamızda karnosol’un TNF-α ve IL-6 gibi IL-1β üzerine de etkili olan güçlü bir antiinflamatuar ajan olduğu gözlendi.

Bakteriyel translokasyon intestinal lümendeki canlı bakteri ve/veya bakteri ürünlerinin bağırsak bariyerini geçerek lenf düğümleri, karaciğer, dalak ve kan dolaşımına geçtiği durum olarak tanımlanır. Bazı patolojik durumlarda diğer sistemik organlara gastrointestinal lümenden bakteri ve bakteri ürünleri geçişi meydana gelir. Bu sürece bakteriyel translokasyon denir (50).

Yapılan bazı çalışmalarda karnosol’un antioksidan ve antibakteriyel etkilerininin incelemesi neticesinde karnosol’un gram (+) bakterilere gram (–) bakterilerden daha etkili olduğunu bildirmişlerdir (85, 86).

Bernardes ve arkadaşları (99) yaptıkları çalışmada ise Biberiye bitkisinin oral patojenler üzerindeki antimikrobiyal etkisini araştırmışlar. Sonuç olarak Streptococcus

mutans, S. salivarius, S. sobrinus, S. mitis, S. sanguinis, ve Enterococcus faecalis gibi oral

patojenlere karşı Biberiye ekstresi olan karnosol’un güçlü antimikrobiyel etkisinin olduğunu göstermişlerdir.

Oluwatuyia ve arkadaşları (100) yapmış oldukları çalışmada karnosol’un Metisilin Dirençli staphilococcua aureus (MRSA) üzerindeki antibakteriyel ve direnç geliştirme etkisini incelemişler, eritromisin ve tetrasiklin ile karşılaştırdıklarında, MRSA üzerine karnosol’un antibakteriyel etkisinin daha iyi olduğunu bildirmişler.

Bozin ve arkadaşları (101) biberiye ekstresinin antimikrobiyal ve antioksidan faaliyetlerini inceledikleri çalışmalarında karnosol’un antibakteriel etkinliğinin Esherichia

coli, salmonella typhi, S. Enteritidis ve Shigella sonei’de oldukça yüksek olduğunu

bildirmişlerdir.

Yapmış olduğumuz çalışmada karaciğer, dalak ve mezenter kültürü sonuçları açısından karşılaştırıldıklarında iskemi-reperfüzyon oluşturulan grupta üreyen mikroorganizmanın Escherichia coli olduğu görülmüştür. Kontrol grubu ve karnosol uygulanan grupta ise üremeye rastlanmamıştır. Karnosol’un bakteriyel translokasyonu

önleyerek gram (–) bakterilere karşı istatistiksel olarak anlamlı bir etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir.

Kan damarı oluşumunun ana düzenleyicileri anjiyopoetinlerdir. Anjiyopoetinler, damar oluşumu ve remodellingde rol oynayan büyüme faktörleri ailesinde yer alır. Anjiogenezde rol almaları yanında inflamatuar yanıtı da düzenlemektedirler. Anjiyopoetinler arasında en iyi tanımlananlar Ang-1 ve Ang-2’dir. Özellikle perisitlerden Ang-1, endotel hücrelerinden Ang-2 salgılanmaktadır (58).

Anjiyopoetin-1; Tie-2 reseptör agonisti olup damar yapısının ve fonksiyonlarının korunmasıyla birlikte anti-apoptotik ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Lökositlerin endotele adezyonu ve endotelden geçişi, sitokin üretimi, adezyon molekül salınımını ve damar geçirgenliğini inhibe etmektedir (59-61). Anjiyopoetin-1 NF-ĸB aktivasyonunu inhibe ederek inflamatuar sitokin üretiminin azalmasını sağlar ve inflamatuar bir sitokin olan TNF-α’nın etkisine ters yönde etki eder. Ang-1 düşük TNF-α düzeylerinde kontrolsüz bir inflamatuar yanıtı engeller (62). Ang-1 aracılı PKB-Akt sinyali direk olarak endotel hücre apoptozunu önler ve Ang-2 salınmasını önleyerek endotel aktivasyonuna engel olur.

Ancak literatür taramalarında vasküler permeabilite artışı üzerine karnosol’un koruyucu etkisinin olup olmadığını bildiren herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır

Yapmış olduğumuz çalışmada, doku Ang-1 ve Ang-2 sonuçları açısından gruplar değerlendirildiğinde kontrol grubu ile karnosol uygulanan grup arasında Ang-1 ve Ang-2 sonuçlarının benzerlik gösterdiği görüldü. kontrol ve karnosol uygulanan gruba göre iskemi-reperfüzyon oluşturulan grupta Ang-1 düzeylerinin düşük, Ang-2 düzeylerinin ise yüksek olduğu tespit edildi. Ancak bu farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olmadığı görüldü.

Yao ve arkadaşları (93) deneysel olarak yaptıkları barsak iskemi reperfüzyonun sebep olduğu karaciğer hasarı modelini histapatolojik olarak incelediklerinde tüm ratlarda histolojik değişikliklerin olduğunu, ödem, hemoroji ve nötrofil infiltrasyonu görüldüğünü bunlar yönünden grupları kıyasladıklarında ise karnasol uygulanan ratlarda iskemi reperfüzyon hasarının daha az olduğu bildirilmiştir. Tian ve arkadaşları (92) da deneysel olarak yaptıkları barsak iskemi reperfüzyonun sebep olduğu akciğer hasarı modelinde karnasol kullanımının üstteki literatüre benzer şekilde akciğer hasarını önlemede etkili olduğunu bildirmişlerdir.

Bizim çalışmamızda ise intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası terminal ileumda meydana gelen histopatolojik değişiklikler incelenmiştir. Kontrol grubu ve karnosol uygulanan grup arasında istatistksel olarak anlamlı bir fark bulunmazken, I/R hasarı oluşturulan grup ile karnosol uygulanan grup arasında karnosol lehine istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur.

Sonuç olarak, güçlü antienflamatuar etkisi olduğu bilinen karnosol’un deneysel olarak oluşturulan iskemi reperfüzyon modelinde bakteriyel translokasyon ve ince barsak hasarını önlemedeki etkisinin anlamlı olduğu, vasküler permeabilite artışını önlemedeki beklenen etkisinin ise yeterli olmadığı görülmüştür. Ancak vasküler permeabilite artışını önlemedeki beklenen etkisinin değerlendirilmesinde farklı çalışmaların yapılmasına ihtiyaç vardır.

SONUÇLAR

Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı’nda planlanan çalışmamızda daha önce hiç üzerinde çalışılmayan; sıçanlardaki intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite üzerine karnosol’un koruyucu etkisinin olup olmadığını araştırdık.

Çalışmamız Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarı’nda üniversitemiz Genel Cerrahi, Mikrobiyoloji ve Patoloji Anabilim Dalları ile Gülhane Askeri Tıp Akademisi Biyokimya Anabilim Dalı’nın ortaklaşa çalışması ile gerçekleştirilmiştir.

Deneysel olarak intestinal İ/R oluşturulan ratlardaki karnosol’un etkisinin; sıçanlarda serumda TNF-α, IL-1β ve IL-6 seviyeleri, intestinal doku intestinal Ang-1 ve Ang-2 düzeylerine, karaciğer, dalak ve mezenter doku kültürü ile intestinal dokudaki histopatolojik değişiklikler değerlendirilerek şu sonuçlara ulaşıldı:

1. Serum TNF-α sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken her iki grup, deney grubu ile karşılaştırıldığında serum TNF-α sonuçlarının kontrol grubu ile deney+ilaç grubunda anlamlı derecede düşük olduğu,

2. Serum IL-1β sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken her iki grup, deney grubu ile karşılaştırıldığında serum IL-1β sonuçlarının kontrol grubu ile deney+ilaç grubunda anlamlı derecede düşük olduğu,

3. Serum IL-6 sonuçları açısından kontrol grubu ile deney+ilaç grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaz iken her iki grup, deney grubu ile

karşılaştırıldığında serum IL-6 sonuçlarının kontrol grubu ile deney+ilaç grubunda anlamlı derecede düşük olduğu,

4. Gruplar doku Ang-1 ve Ang-2 sonuçları açısından değerlendirildiğinde, kontrol ve deney+ilaç grubu arasında farklılık olmadığı ancak deney grubunda, kontrol ve deney+ilaç grubuna göre Ang-1 düzeylerinin düşük, Ang-2 düzeylerinin ise yüksek olmasına rağmen bu farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olmadığı,

5. Gruplar karaciğer, dalak ve mezenter kültürü sonuçları açısından değerlendirildiğinde deney grubunda Escherichia coli’nin ürediği, kontrol grubu ve deney+ilaç grubunda ise üreme olmadığı ve karnosol’un bakteriyel translokasyonu önleyici etkiye sahip olduğu,

6. Gruplar patoloji sonuçları açısından değerlendirildiklerinde, kontrol grubu ve deney+ilaç grubu arasında istatistksel olarak anlamlı bir farklılık bulunmadığı, deney grubu ile deney+ilaç grubu karşılaştırıldığında ise karnosol’un intestinal hasarı önleyici etkiye sahip olduğu görülmüştür.

Buna göre; karnosol’un, intestinal iskemi reperfüzyon oluşturulan ratlarda meydana gelen bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite artışını önlemedeki etkinliğini değerlendirdiğimizde biyokimyasal, mikrobiyolojik ve histopatolojik etkilerinin anlamlı düzeyde olumlu olduğu, vasküler permeabilite artışı üzerine olan olumlu etkisinin ise anlamlı olmadığı sonucuna varılmıştır.

ÖZET

İskemi bir dokuya gelen kan akımının azalması veya kesilmesi olarak tanımlanır. Reperfüzyon ise kan akımının yeniden başlamasıdır. İskemi sonrasında dokuda hücresel fonksiyon bozukluklarına neden olacak bir dizi kimyasal olay başlar. Yeniden kanlanma ile dokudaki hasar miktarı giderek artar. Çeşitli nedenlerden oluşan iskemi reperfüzyona bağlı gelişen akut iskemi, vasküler permeabilite artışına ve bakteriyel translokasyona sebep olmaktadır. Deneysel iskemi reperfüzyon modeli üzerinde antioksidanların etkileri ile ilgili çalışmalar son yıllarda hız kazanmıştır.

Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı’nda planlanan ve Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarı’nda gerçekleştirilen çalışmamızda daha önce hiç üzerinde çalışılmayan intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası oluşan bakteriyel translokasyon ve vasküler permeabilite üzerine karnosol’un beklenen koruyucu etkisini göstermeyi amaçladık.

Aynı biyolojik ve fizyolojik özelliklere sahip 30 adet Sprague Dawley tek cins rattan rastgele seçimle üç grup oluşturuldu.

Grup 1: Kontrol grubu.

Grup 2: Deney (iskemi-reperfüzyon) grubu. Grup 3: Deney+ilaç (I/R+karnosol) grubu.

Tüm gruplardaki ratlara 7 gün süreyle standart yem ve su verildi. Deney+ilaç grubuna toz halindeki karnosol %10 dimetil sülfoksid (DMSO) ile çözüldükten sonra, operasyondan 3 gün önce başlayarak intraperitoneal yolla 3 mg/kg/gün dozunda verildi. Bütün ratlara ilk operasyondan 12 saat önce orogastrik yolla 1 ml 1010 _{CFU/ml E-coli verildi. 7. günün}