Ham ekstrelerin sitotoksik etkilerine ilişkin bulgular

90

91

Şekil 4.2. DU 145 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir.

92

SRB hücre canlılık testiyle elde edilen sonuçlar incelendiğinde; ham ekstrelerin (A-K), PC-3 hücrelerinde DU 145 hücre hattına benzer bir sitotoksik aktivite gösterdiği belirlendi (Şekil 4.3). PC-3 hücrelerinde, E ve H kodlu ekstrelerin negatif kontrol ile karşılaştırıldığında doza ve zamana bağımlı olarak sitotoksik etkiler gösterdiği bulundu (p<0,05). Bu ekstreler, söz konusu etkilerini yüksek dozlarda (200 ve 100 μg/ml) gösterirken, daha düşük dozlarda dikkate değer bir etki tespit edilemedi. D, G ve K kodlu ekstrelerin uygulandığı PC-3 hücrelerinde, konsantrasyon arttıkça hücre canlılık oranlarında anlamlı azalmalar (p<0,05) gözlense de sitotoksik açıdan en önemli etkiler, ekstrelerin sadece 200 μg/mlʼlık dozlarında saptandı. PC-3 hücrelerinde, taranan tüm ekstreler arasında en zayıf sitotoksik etkiyi gösteren ekstreler; B, C ve K kodlu ekstreler olarak belirlendi. Ancak, DU 145 hücrelerinin aksine PC-3 hücrelerinde, bu ekstrelerin 200 μg/mlʼlık dozlarının hücre canlılıklarını ciddi oranda azalttığı görüldü (p<0,05). A ve F kodlu ekstrelerin, PC-3 hücreleri üzerindeki etkisi ise antiproliferatif/sitostatik olarak değerlendirildi.

93

Şekil 4.3. PC-3 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir.

94

Ham ekstre uygulanan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin SRB hücre canlılık testiyle doza karşı yüzde canlılık grafiklerinden türetilen ve hücrelerin %50ʼsini öldüren inhibitör konsantrasyon olarak ifade edilen IC50 değerleri, Çizelge 4.2ʼde verildi. IC50 değerleri dikkate alındığında, her iki hücre hattında da en iyi sitotoksik aktivitelerin 72 saatlik tedavi süresinde elde edildiği görüldü. Bu sonuç; ham ekstreler ile daha uzun süreli tedavinin, daha düşük IC50 dozlarına ve buna bağlı olarak daha yüksek sitotoksik etkilere neden olmasıyla açıklandı. Ham ekstrelerin uygulandığı DU 145 ve PC-3 hücrelerinde tespit edilen en düşük IC50 dozları E ve H kodlu ekstrelere aittir. 72 saatlik uygulama için E kodlu ekstrenin DU 145 hücrelerindeki IC₅₀ dozu 67,14 μg/ml, PC-3 hücrelerindeki IC₅₀ dozu ise 94,50 μg/ml olarak belirlendi. H kodlu ekstre için 72. saatte elde edilen IC₅₀ değerleri ise sırasıyla; DU 145 hücre hattında 55,96 μg/ml, PC-3 hücre hattında 87,17 μg/ml olarak bulundu. Bu ekstrelerin etki derecelerine benzer etkinlik gösteren diğer ekstrelerin D ve G kodlu ekstreler olduğu görüldü. SRB testiyle elde edilen IC₅₀ değerleri kıyaslandığında, DU 145 hücrelerinin D, E, G ve H kodlu ekstrelere PC-3 hücrelerinden daha duyarlı olduğu bulundu. Bunlara ek olarak; B, C ve K kodlu ekstrelerin PC-3 hücrelerinde daha etkili olduğu ancak bu ekstreler için hesaplanan IC50 dozlarının nispeten yüksek olduğu belirlendi. Her iki hücre hattında, A ve F kodlu ekstreler için ise etkin dozlar belirlenememiş olup hesaplanan IC50 değerleri uygulanan doz aralığının dışındadır (IC50 >200 μg/ml).

Çizelge 4.2. Epilobium hirsutum L. ham ekstrelerinin SRB testiyle hesaplanan IC50

dozları

Ham Ekstreler

IC50 Dozları (μg/ml)

DU 145 PC-3

24 Saat 48 Saat 72 Saat 24 Saat 48 Saat 72 Saat A >200 >200 >200 >200 >200 >200 B >200 >200 >200 >200 >200 188,80 C >200 >200 >200 >200 >200 140,63 D >200 124,60 79,26 >200 173,08 124,86

E 157,89 95,37 67,14 >200 145,12 94,50

F >200 >200 >200 >200 >200 >200 G >200 138,25 91,67 >200 >200 136,97

H 169,23 87,93 55,96 >200 136,70 87,17

K >200 194,26 141,15 >200 179,45 115,29

95 XTT hücre canlılık testi bulguları

Ham ekstrelerin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerini doğrulamak için, XTT hücre canlılık testinden yararlanıldı. Ham ekstrelerin 3,13-200 μg/ml aralığında yer alan konsantrasyonları ile 24, 48 ve 72 saatlik tedaviden sonra elde edilen sonuçlara göre, E kodlu ekstrenin DU 145 hücre hattına karşı en güçlü sitotoksik aktiviteyi gösterdiği tespit edildi (Şekil 4.4). Bu ekstrenin, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, DU 145 hücre canlılıklarını doza ve zamana bağımlı olarak anlamlı şekilde azalttığı görüldü (p<0,05). Ancak, bu ekstrenin uygulanan tüm dozlarda sitotoksik etki göstermediği belirlendi. 24 saatlik tedavi sonrası, E kodlu ekstrenin sadece 200 μg/mlʼlik dozunda sitotoksik etki gözlenirken 48 ve 72 saatlik muameleler sonucu, hem 200 μg/ml hem de 100 μg/ml konsantrasyonlarda sitotoksik etki incelendi.

E kodlu ekstrenin daha düşük dozlarının ise, DU 145 hücreleri üzerinde antiproliferatif/sitostatik olarak etki gösterdiği belirlendi. E kodlu ekstreden sonra, DU 145 hücrelerine karşı en iyi sitotoksik aktiviteyi gösteren ekstreler; D, G ve H kodlu ekstreler olup bu ekstrelerin etki dereceleri birbirine benzerdir. K kodlu ekstrenin, DU 145 hücreleri karşında en güçlü sitotoksik etkiyi kısa süreli tedavide (24. saat) göstermesi bu çalışma için dikkat çekici bir sonuç oldu.

96

Şekil 4.4. DU 145 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir.

97

Şekil 4.5ʼde gösterildiği gibi, taranan tüm ham ekstrelerin, PC-3 hücre hattında diğer hücre hattına benzer sitotoksik aktivite sergilediği incelendi. Bu hücre hattında da, sitotoksik açıdan en yüksek etki E kodlu ekstrede tespit edildi. Bu ekstre ile muamele sonrası, konsantrasyon ve tedavi süresi artışına bağlı olarak PC-3 hücre canlılıklarında, negatif kontrole kıyasla, anlamlı azalışlar olduğu belirlendi (p<0,05). 24. saatte, bu ekstrenin yalnızca 200 μg/mlʼlik dozunun sitotoksik olarak, daha düşük dozlarının (3,13-100 μg/ml) ise antiproliferatif/sitostatik olarak etkili olduğu görüldü. Bunun aksine, tedavi süresinin 48. ve 72. saatlerinde, ekstrenin hem 200 μg/ml hem de 100 μg/mlʼlik dozlarının sitotoksisiteye yol açtığı gözlendi. Bu süre içinde, diğer dozların (3,13-50 μg/ml) sitotoksik etkiden çok hücre çoğalmasını baskılayıcı yönde etki gösterdiği bulundu. 24-72 saatlik tedavi aralığında, PC-3 hücrelerine karşı E kodlu ekstre haricinde en iyi sitotoksik aktiviteyi sergileyen diğer ekstreler; D, G ve H kodlu ekstrelerdir. Bu ekstrelerin aktiviteleri birbirine yakın düzeydedir. Tüm bunlara ilave olarak; 72 saatlik tedaviden sonra, K kodlu ekstreye ait 200 μg/mlʼlik konsantrasyonun PC-3 hücrelerinde sitotoksik etkiye neden olduğu belirlendi. A, B, C ve F kodlu ekstrelerin ise antiproliferatif/sitostatik etkili olduğu, ancak DU 145 hücrelerinden farklı olarak PC-3 hücrelerinin C kodlu ekstreye daha duyarlı olduğu gözlendi.

98

Şekil 4.5. PC-3 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir.

99

Ham ekstrelerin sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesinde önemli olan IC50 değerleri, DU 145 ve PC-3 hücrelerine ait XTT hücre canlılık testi sonuçlarından yola çıkılarak hesaplandı. Çizelge 4.3ʼde verilen sonuçlar incelendiğinde, her iki hücre hattında da ham ekstrelere ait en düşük IC50 değerleri 72 saatlik tedavi sonunda belirlendi. İstisnai olarak, K kodlu ekstre için en güçlü sitotoksik etki, 24. saatte ve sadece DU 145 hücre hattında tespit edildi (IC50 dozu: 83,78 μg/ml). Hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerinde en düşük IC50 değerlerinin hesaplandığı dolayısıyla en güçlü sitotoksik aktiviteyi sergileyen ekstrenin, E kodlu ekstre olduğu saptandı. 72 saatlik muamelenin ardından, E kodlu ekstrenin DU 145 hücrelerindeki IC₅₀ dozu 64,58 μg/ml iken, PC-3 hücrelerindeki IC₅₀ dozu 53,23 μg/ml olarak hesaplandı. Bu sonuç, hücrelerin bu ekstreye karşı duyarlılıklarının benzer olduğu göstermektedir. Sitotoksik etki olarak nispeten birbirine yakın sonuçlar veren diğer ekstreler; D, G ve H kodlu ekstrelerdir ve bu etki, iki hücre hattında da geçerlidir. Ancak, hücrelerin D kodlu ekstreden çok G ve H kodlu ekstreler ile tedaviye daha iyi yanıt verdiği gözlendi. Ayrıca, K kodlu ekstrenin hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerine karşı zayıf sitotoksik etki gösterdiği belirlendi.

A, B, C ve F kodlu ekstreler için ise sitotoksisiteye dair olumlu bir bulgu elde edilememiş olup IC50 değerleri iki hücre hattı için de doz aralığının dışındadır (IC50

>200 μg/ml).

Çizelge 4.3. Epilobium hirsutum L. ham ekstrelerinin XTT testiyle hesaplanan IC50

dozları

Kısaca özetlemek gerekirse; farklı E. hirsutum ekstrelerinin test edilen hücre hatları karşısındaki sitotoksik etkileri ilk önce SRB hücre canlılık testiyle araştırıldı. Daha

Ham Ekstreler

IC50 Dozları (μg/ml)

DU 145 PC-3

24 Saat 48 Saat 72 Saat 24 Saat 48 Saat 72 Saat A >200 >200 >200 >200 >200 >200 B >200 >200 >200 >200 >200 >200 C >200 >200 >200 >200 >200 >200 D >200 180,23 104,50 >200 >200 124,77

E 143,39 85,93 64,58 129,49 81,67 53,23

F >200 >200 >200 >200 >200 >200

G >200 >200 94,67 >200 200 109,91

H >200 >200 99,02 >200 200 100,46

K 83,78 >200 >200 >200 >200 162,94

100

sonra, bu testten elde edilen verilerin doğruluğunu teyit etmek için seçilen alternatif bir test ile aynı deneysel şartlar altında analiz yapılması planlandı. Bu amaçla, XTT hücre canlılık testi kullanılarak ikinci bir deney yürütüldü. Sonuç olarak, bu iki farklı testten elde edilen bulguların birbiriyle uyumlu olduğu ve SRB testiyle hesaplanan IC50

dozlarının görece düşük olduğu bulundu.

Bu bulgulardan yola çıkarak, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde en güçlü sitotoksik etki, su içinde maserasyon yöntemiyle hazırlanan E kodlu ekstrede görüldü. Bu bağlamda, biyolojik aktivite rehberli olarak aktiviteden sorumlu bileşikleri tanımlayabilmek için sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi kullanılarak E kodlu ekstreden kaba fraksiyonlama gerçekleştirildi.