Çalışma için Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Araştırmalar Etik Kurulu’ndan 05 Haziran 2012 tarih ve20012-12/11 sayılı karar no ile izin alındı.
Bakteriler
Çalışmaya Haziran 2011 – Haziran 2012 tarihleri arasında Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bakteriyoloji Laboratuvarı’na kültür için gönderilen klinik örneklerden izole edilen; Phoenix (Becton Dickinson, Amerika Birleşik Devletleri) otomatize bakteri tanımlama ve duyarlılık test sisteminin NMIC/ID-99 ve UNMIC/ID-83 panellerinde identifiye edilen; imipenem (IMP) ve/veya meropeneme (MRP) CLSI kriterlerine göre dirençli bulunan 35’i Pseudomonas spp., 35’i Acinetobacter spp. olmak üzere toplam 70 izolat dahil edildi. Aynı hastanın tekrarlayan izolatları çalışmaya alınmadı.
Pozitif kontrol olarak fenotipik ve moleküler testlerle daha önce MBL ürettiği belirlenmiş, VIM-1 tipi enzime sahip P. aeruginosa ile IMP-1 ve NDM tipi enzime sahip K. pneumoniae suşları; standart suş olarak ise imipeneme duyarlı E. coli ATCC 25922 suşu kullanıldı.
32 Cihazlar
Phoenix otomatize bakteri tanımlama ve duyarlılık test sistemi (Becton Dickinson, Amerika Birleşik Devletleri)
Termal döngü cihazı (Biometra, Almanya) (DNA izolasyonu için)
Termal döngü cihazı (ESCO Swift Max Thermal Cycler, Amerika Birleşik Devletleri) (DNA amplifikasyonu için) Elektroforez tankı (BioRad MINI-SUBR Cell GT, Amerika Birleşik Devletleri) Elektroforez tankı güç kaynağı (BioRad Power PAC 300, Amerika Birleşik Devletleri)
UV transilüminatör (Major Science UV Transilluminator, Amerika Birleşik Devletleri)
Derin dondurucu -20ºC (Bosch, Almanya)
Derin dondurucu -86ºC (MDF-U72V, Sanyo, Japonya) Etüv (Nüve EN 120, Türkiye)
Mikrodalga fırın (Arçelik intellowave, Türkiye)
Spektrofotometre (Thermo NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer, Amerika Birleşik Devletleri)
Nefelometre cihazı (CrystalSpecTM, Becton Dickinson, Amerika Birleşik Devletleri)
Otoklav (Nüve OT 4060 V, Türkiye)
Elektronik tartı (Shimadzu AUW220 D, Japonya) Soğutmalı santrifüj (Hermle Z216MK, Almanya)
Medikal su arıtma cihazı (RentRO 2000, Kros, Türkiye ) Manyetik karıştırıcı (Boeco MSH 200, Almanya )
33 Besiyerleri ve Çözeltiler
Colombia agar besiyeri (Becton Dickinson, BBL, Almanya) (%5 koyun kanı içeren kullanıma hazır besiyeri)
Mueller Hinton agar (MHA) besiyeri (Oxoid, İngiltere) MHA besiyerinin hazırlanışı:
Üretici firmanın önerisine göre 38 g toz besiyeri 1 litre distile suda eritildi, 121°C’de 15 dakika otoklavda steril edildi. Besiyeri 50°C'ye kadar soğutulduktan sonra 9 cm çapında steril plastik petri kutularına 4 mm kalınlığında döküldü. Modifiye Hodge testi, Etest, çift disk sinerji testi ve kombine disk testi uygulamaları için kullanıldı.
Etilendiamintetraasetikasit (EDTA) (Sigma, Almanya) 0.5 M EDTA stok çözeltisinin hazırlanışı:
Kombine disk testi ve çift disk sinerji testi uygulamaları ile agaroz jel hazırlığında kullanılan bu çözelti için 1 litre distile suda 186.1 g EDTA eritildi, NaOH ile pH 8.0'e ayarlandı.
Tris-base (Sigma-Aldrich, Almanya) Borik asit (Sigma-Aldrich, Almanya)
10xTris-Borik asit-EDTA (TBE) stok tampon çözeltisinin (pH:8.4) hazırlanışı:
Tris-base (108 g), borik asit (55 g) ve 0.5 M EDTA stok çözeltisi (40 mL) üzerine toplam hacim 1 litre olacak şekilde distile su ilave edildi, manyetik karıştırıcıda eritildi, oda sıcaklığında muhafaza edildi. Agaroz jel hazırlamak için 0.5xTBE kullanıldı. Bu amaçla 50 mL 10xTBE tampon çözeltisi 950 mL distile su ile karıştırıldı.
34 Diğer Malzemeler
Burgulu, kapaklı steril tüp (15 mL) (Becton Dickinson, Amerika Birleşik Devletleri)
Mikrobank (Mast Diagnostics, Almanya)
Ependorf tüpü (1.5, 0.5 ve 0.2 mL) (AHN Biotechnologie GmbH, Almanya) Mikropipet (10, 100, 1000 µL) (Gilson, Amerika Birleşik Devletleri)
Steril eküviyon (Citoswab, Çin)
Steril petri kutusu (90 mm çapında) (Fıratmed, Türkiye) IMP diski 10 μg (Oxoid, İngiltere)
Seftazidim (CAZ) diski 30 μg (Oxoid, İngiltere) Boş disk (Oxoid, İngiltere)
Etest MBL şeridi (Bir ucunda 4-256 μg/mL IMP, diğer ucunda 1-64μg/mL IMP+EDTA içeren) (Biomerieux, Fransa)
2-merkaptopropiyonik asit (2-MPA) (Merck, Almanya) Taq polimeraz (Fermentas, Amerika Birleşik Devletleri) dNTP karışımı 10 mM (Bio Basic Inc., Kanada)
10x PCR tamponu (Fermentas, Amerika Birleşik Devletleri) MgCl2 2.5 mM (Fermentas, Amerika Birleşik Devletleri)
DNA markerı (Bio Basic Inc., DNA 100 bp Ladder Marker, Kanada) MBL primer seti (4 çift) (Genmar Diagnostic Company, Türkiye) Yükleme tamponu (Bio Basic Inc., Kanada)
Agaroz (Agaroselow EEO, AppliChem, Almanya)
Parafilm M 4'' x 125' (Pechiney Plastic Packaging Inc., Şikago)
35
Çalışmaya alınan suşların saf kültürlerinden steril eküviyonla bol miktarda alınarak mikrobank saklama tüplerinde yoğun bakteri süspansiyonları hazırlandı. Mikrobank tüpleri çalkalanarak süspansiyon içindeki bakterilerin tüplerin içerisinde yer alan adsorban boncuklarla temas etmesi sağlandı. Daha sonra tüplerin içindeki sıvılar aspire edilerek çalışma yapılıncaya kadar -20ºC’lik derin dondurucuda saklandı.
Çalışma öncesi saklanan suşların mikrobank tüplerinden %5 koyun kanlı Colombia agara pasajları yapıldı. Saf kültürler aerop koşullarda, 35ºC’de, 18-24 saatlik inkübasyon sonucu elde edildi.
Fenotipik Yöntemler
Modifiye Hodge Testi (MHT)
Hodge testi aslında penisilinaz üreten Neisseria gonorrhoeae'yi tespit etmek için geliştirilmiş bir yöntemdir (88). Bu test MBL varlığının gösterilmesi için penisiline duyarlı S. aureus ATCC 25923 yerine E. coli ATCC 25922 standart suşu ve 10 U penisilin diski yerine 10 μg IMP diski kullanılarak modifiye edilmiştir ve MHT olarak adlandırılmıştır (89).
Yapılışı:
1. Standart E. coli ATCC 25922 suşunun 0.5 McFarland yoğunluğunda hazırlanan süspansiyonu 10 kat sulandırılarak steril eküviyon yardımıyla MHA besiyerinin tüm yüzeyine inoküle edildi.
2. Petrinin ortasına bir adet IMP diski yerleştirilerek test edilecek 3 bakteri ve pozitif kontrol olarak IMP-1 pozitif K. pneumoniae suşu disk kenarından perifere doğru çizgi şeklinde yoğun olarak ekildi.
3. Aerob koşullarda 35ºC’de 24 saat inkübasyon sonrası E. coli’ye ait inhibisyon zonunda görülen bozulma MBL pozitif olarak değerlendirildi.
36 Etest Yöntemi
1. Test edilecek bakterinin 0.5 McFarland bulanıklığında hazırlanan süspansiyonu steril bir eküviyon yardımıyla MHA besiyerinin tüm yüzeyine yayıldı.
2. Besiyeri yüzeyinin kurumasını takiben bir ucunda IMP (4-256 μg/mL), diğer ucunda IMP (1-64 μg/mL)+EDTA içeren Etest şeridi besiyeri yüzeyine yerleştirildi.
3. Aerob koşullarda 35ºC’de 24 saat inkübasyon sonrası birbirine zıt yönde oluşan iki elipsin şeritle kesiştiği noktalara denk gelen MİK değerleri belirlendi ve birbirine oranlandı.
4. IMP MİK değerinin IMP+EDTA MİK değerine oranının 8 ve üzeri olması (IMP MİK değerinin EDTA varlığında 3 log2 dilüsyon ve üzerinde azalması) MBL pozitif olarak değerlendirildi. Ayrıca Etest şeridinin IMP veya EDTA içermeyen orta bölümünde “fantom zon”
(hayalet bölge) olarak adlandırılan görüntünün izlenmesi de MBL pozitif olarak yorumlandı.
Çift Disk Sinerji Testi (ÇDST)
Bu testin temeli, değişik beta-laktam antibiyotiklere karşı oluşan inhibisyon zonunun çeşitli metal şelatörler varlığında genişlemesi veya
“fantom zon” oluşması mekanizmasına dayanmaktadır (90).
Yapılışı:
1. Test edilecek bakterinin 0.5 McFarland bulanıklığında hazırlanan süspansiyonu steril bir eküviyon ile MHA besiyerinin yüzeyine yayıldı.
2. Besiyerinin kurumasını takiben Pseudomonas izolatları için CAZ diski ve boş disk, Acinetobacter izolatları için IMP diski ve boş disk aralarında merkezden merkeze 2 cm uzaklık olacak şekilde MHA besiyeri üzerine yerleştirildi.
3. Boş diske 5 μL 2-MPA emdirildi.
4. Aerob şartlarda 35ºC’de 24 saat inkübasyon sonrası diskler arasında artmış inhibisyon zonu veya fantom zon görülmesi MBL pozitif olarak değerlendirildi.
37
Boş diskte bulunan 2-MPA’nın (5 μL) Pseudomonas türlerinin üremesini fazla inhibe ettiği ve testin değerlendirilmesini zorlaştırdığı tespit edildiğinden bu bakteriler için 3 μL 2-MPA içeren diskler kullanılarak test tekrar edildi. Ayrıca Pseudomonas türleri için daha uygun olup olmadığını belirlemek amacıyla birbirlerine uzaklığı merkezden merkeze 2 cm olacak şekilde IMP diski ve 10 μL 0.5 M EDTA emdirilen boş disk ile de ÇDST yapıldı.
5. Pozitif kontrol suşlarına aynı test prosedürü uygulandı.
Kombine Disk Testi (KDT)
1. Test edilecek suşların 0.5 McFarland bulanıklığında hazırlanan süspansiyonları steril eküviyon yardımı ile MHA besiyerlerine yayıldı.
2. Besiyerinin kurumasını takiben Acinetobacter spp. için besiyeri üzerine kenarları arasında 1.5-2 cm mesafe olacak şekilde 2 adet IMP diski, Pseudomonas spp. için 2 adet CAZ diski yerleştirildi.
3. Disklerden birer tanesine10 μL 0.5 M EDTA çözeltisi emdirildi.
4. Aerob şartlarda 35ºC’de 24 saat inkübasyon sonrası EDTA emdirilmiş ve emdirilmemiş disklerin inhibisyon zon çapları ölçüldü. Aralarında 7 mm ve daha fazla fark bulunması MBL pozitif olarak değerlendirildi.
5. Pozitif kontrol suşlarına aynı test prosedürü uygulandı.
Moleküler Yöntemler
Çalışmaya alınan izolatlar PCR analizi ile blaIMP, blaVIM, blaSPM ve blaNDM genleri yönünden PCR ile incelendi.
Primerlerin Seçilmesi ve Hazırlanması
Çalışmada epidemiyolojik yayılım ve klinik ilişki açısından önemli olan IMP, VIM, SPM ve NDM tipi enzimlerin genlerine yönelik 4 çift primer kullanıldı (3, 91). Primerlerin özellikleri Tablo 4’te gösterilmiştir.
38
Liyofilize primerler üretici firmanın önerdiği protokole uygun olarak sulandırıldı. Önce 100 μM’lık stok çözeltiler, bu çözeltilerden 10 μM’lık porsiyonlar hazırlandı. Primerler kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklandı.
DNA İzolasyonu
1. Mikrobank tüplerinden %5 koyun kanlı Colombia agara aktarılarak canlandırılan bakterilerin ve MBL pozitif kontrol suşlarının (blaIMP-1 pozitif K. pneumoniae, blaNDM pozitif K. pneumoniae ve blaVIM pozitif P. aeruginosa) MHA besiyerine pasajları yapıldı.
Aerob şartlarda 35ºC’de 24 saat inkübasyon sonrası elde edilen saf kültürlerden distile su ile McFarland 4-5 bulanıklığında süspansiyonlar hazırlandı.
2. Bakteri süspansiyonlarından 500 µL alınarak 0.5 mL’lik ependorf tüplerine aktarıldı.
3. Ependorf tüpleri -80ºC’de 24 saat bekletildi, ardından bakteri süspansiyonlarının oda sıcaklığında iyice çözülmesi sağlandı.
4. Daha sonra ependorf tüpleri termal döngü cihazına yerleştirilerek 99ºC’de 15 dakika bekletildi.
39
5. Tüpler 11.000xg’de 4 dakika, +4ºC’de santrifüj edildi.
6. Süpernatandan 200 µL alınarak 0.2 mL’lik ependorf tüpüne aktarıldı.
7. Süpernatanların spektrofotometrede DNA kantitasyonu yapıldı.
8. Süpernatanlar amplifikasyon işleminde kalıp olarak kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklandı.
DNA Amplifikasyonu
blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaSPM genlerine yönelik PCR
DNA amplifikasyonu her izolat için 0.2 mL’lik ependorf tüpünde, 25 μL PCR karışımında gerçekleştirildi. Her reaksiyon karışımı son hacimde 1xPCR tampon, 1.5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0.3 μM her bir primer ve 2.5 U/100μL Taq polimeraz olacak şekilde distile su ile 23 μL’ye tamamlandı ve 2 μL DNA ekstraktı eklenerek son hacmin 25 μL olması sağlandı.
Ependorf tüpleri termal döngü cihazına yerleştirilerek blaIMP, blaNDM, blaSPM genlerine yönelik DNA amplifikasyon döngüsü 94ºC’de 10 dakika ilk denatürasyon; sonrasında 36 siklus boyunca 94ºC’de 30 saniye denatürasyon, 52ºC’de 40 saniye bağlanma, 72ºC’de 50 saniye uzama ve 72ºC’de 5 dakika son uzama olarak gerçekleştirildi.
blaVIM genlerine yönelik DNA amplifikasyon döngüsü, 94ºC’de 10 dakika ilk denatürasyon; sonrasında 36 siklus boyunca 94ºC’de 30 saniye denatürasyon, 59ºC’de 40 saniye bağlanma, 72ºC’de 50 saniye uzama ve 72ºC’de 5 dakika son uzama olarak gerçekleştirildi.
PCR Ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforezi ile Elde Edilmesi
Amplifikasyon işlemi sonrasında oluşan ürünleri gösterebilmek amacı ile amplikonlar agaroz jel içerisinde elektrik akımına tabi tutuldu.
1. Elektroforez matriksi olarak kullanılmak üzere %2’lik agaroz jel hazırlanışı:
a. Cam balonda 0.8 gr agaroz üzerine 40 ml 0.5xTBE ilave edildi.
b. Homojenizasyon sağlanana kadar karışım mikrodalga fırında eritildi.
c. Karışım oda sıcaklığında bekletilerek 60ºC’nin altına düşmeyecek şekilde soğutuldu.
40
d. Eriyik haldeki agaroz içerisine 10 mg/mL’lik etidyum bromid stok çözeltisinden 4 μL eklendi, karıştırıldı.
e. Hazırlanan agaroz jel, kenarları kapatılmış ve tarakları uygun olarak yerleştirilmiş jel kaseti üzerine sızıntı ve kabarcık olmayacak şekilde yavaşça döküldü.
f. Jel kalıbı katılaşması için oda sıcaklığında 20-25 dakika bekletildi.
g. Jel kalıbı katılaştıktan sonra taraklar dikkatlice çıkarıldı ve kalıp elektroforez tankına yerleştirildi.
2. Parafilm üzerine her bir örnek (amplifikasyon ürünü), 1 adet DNA markerı ve 1 adet ilgili pozitif kontrol için 2’şer μL yükleme tamponu konuldu.
3. Örnekler, DNA markerı ve pozitif kontrolden 10’ar μL alınarak parafilm üzerindeki yükleme tamponu ile karıştırıldı.
4. Karışımlardan 10’ar μL alınarak jel kalıbı üzerindeki kuyulara aktarıldı.
5. Tankın güç kaynağı 100 V akımda çalıştırılarak 1 saat süreyle elektroforez uygulandı.
PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi
Elektroforez işlemi sonunda jel UV transilüminatör üzerine alındı.
Burada UV ışığı (~304 nm) altında jelin dijital fotoğrafı çekildi. Amplifiye edilen DNA’nın molekül ağırlığı, DNA markerı ile karşılaştırılarak değerlendirildi.
41 BULGULAR
Çalışmaya alınan imipenem ve/veya meropeneme dirençli 70 izolatın 24’ü A. baumannii, 9’u A. baumannii/calcoaceticus complex, 2’si Acinetobacter spp., 32’si P. aeruginosa, 3’ü P. putida olarak identifiye edildi.
Acinetobacter ve Pseudomonas suşlarının izole edildikleri örnek tiplerine göre dağılımı Şekil-7’de gösterilmiştir. Endotrakeal aspirat (ETA) her iki mikroorganizmanın en sık izole edildiği örnek (n:21, %30) olup; bunu idrar (n:10, %4,3), yara-pü (n:9, %12,9) ve kan (n:7, %10) izlemektedir.
Acinetobacter izolatlarının örnek dağılımında ilk üç sırada ETA (n:11), kan ve yara-pü (n:7) ile beyin omurilik sıvısı (BOS) ve idrar (n:3) bulunmakta; Pseudomonas suşları için ise sıralamada ETA (n:10), idrar (n:7) ile kateter ve balgam (n:4) örnekleri yer almaktadır (Şekil-7).
Şekil-7: Karbapenem dirençli Acinetobacter ve Pseudomonas suşlarının izole edildikleri örnek tiplerine göre dağılımı.
Büyük çoğunluğu (n:38, %54,2) Yoğun Bakım Üniteleri’nde takip ve tedavi edilen hastalara ait olan karbapenem dirençli Acinetobacter ve Pseudomonas suşlarının kliniklere göre dağılımında ilk üç sırada 4’er örnek
42
ile Onkoloji ve Göğüs Hastalıkları; 3’er örnek ile Üroloji, Ortopedi ve Travmatoloji; 2’şer örnek ile Enfeksiyon Hastalıkları, Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi, Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları, Nöroşirürji ve Göğüs Cerrahisi klinikleri yer almaktadır (Şekil-8 ve Şekil-9).
Şekil-8: Yatarak ve ayaktan takip edilen hastalarda karbapenem dirençli Acinetobacter ve Pseudomonas suşlarının dağılımı.
Şekil-9: Karbapenem dirençli Acinetobacter ve Pseudomonas suşlarının kliniklere göre dağılımı.
YB: Yoğun Bakım ÇEH: Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları GC: Genel Cerrahi ÇSH: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları GH: Göğüs Hastalıkları FTR: Fizik Tedavi ve Rehabilitasyon
OT: Ortopedi ve Travmatoloji KHD: Kadın Hastalıkları ve Doğum EH: Enfeksiyon Hastalıkları GÖC: Göğüs Cerrahisi
PRC: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi KDC: Kalp ve Damar Cerrahisi
43
Acinetobacter ve Pseudomonas izolatlarının antibiyogram sonuçları Tablo-5 ve 6’da gösterilmiştir.
Acinetobacter suşlarında %62,8 amikasin, %80 gentamisin, %88,5 sefepim, %91,4 trimetoprim-sülfametoksazol, %97,1 siprofloksasin, %100 imipenem, meropenem, seftazidim ve piperasilin-tazobaktam; Pseudomonas izolatlarında ise %11,4 amikasin, %45,7 siprofloksasin, piperasilin-tazobaktam, %51,4 sefepim, gentamisin, %54,2 seftazidim, %74,2 aztreonam, %85,7 imipenem, %88,5 meropenem direnci saptandı.
Pseudomonas suşlarının 26’sında (%74,2) imipenem ve meropenem direnci birlikte bulundu.
Florokinolon ve aminoglikozit direncine sahip, beta-laktam grubu antibiyotiklerden (seftazidim, meropenem, imipenem, sefoperazon-sulbaktam) en az birine dirençli olan izolat, çoklu ilaç dirençli olarak kabul edildi. Buna göre 35 Pseudomonas izolatının 10’u (%28,5), 35 Acinetobacter izolatının 31’i (%88.5) çoklu ilaç direncine sahip olarak değerlendirildi.
44 Tablo-5: Acinetobacter izolatlarının MİK değerleri (μg/mL).
İZOLAT
Amikasin Ampisilin- sulbaktam Sefepim Sefoperazon- sulbaktam Sefotaksim Seftazidim Siprofloksasin Kolistin Gentamisin İmipenem Levofloksasin Meropenem Piperasilin- tazobaktam Tetrasiklin Trimetoprim sulfametoksazol
A1 >32 R >16/8 R >16 R * >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A2 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A3 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A4 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A5 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S =8 I >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A6 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A7 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A8 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A9 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R =4 S >4/76 R A10 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A11 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A12 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A13 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S =8 I >8 R >4 R >8 R >64/4 R ≤2 S >4/76 R A14 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A15 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R =4 S =2/38 S A16 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R =8 I >4/76 R A17 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A18 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R =0.5 S ≤1 S >8 R >8 R ≤1 S >8 R >64/4 R 4 S >4/76 R
R: Dirençli S: Duyarlı
I: Orta derece duyarlı
*: Çalışılmadı
45 Tablo-5 (devamı): Acinetobacter izolatlarının MİK değerleri (μg/mL).
İZOLAT Amikasin Ampisilin- sulbaktam Sefepim Sefoperazon- sulbaktam Sefotaksim Seftazidim Siprofloksasin Kolistin Gentamisin İmipenem Levofloksasin Meropenem Piperasilin- tazobaktam Tetrasiklin Trimetoprim sulfametoksazol
A19 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A20 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S ≤2 S >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R
A21 =32 I =16/8 I =16 I =32/8 R =16 I =32 R >2 R * >8 R >8 R * >8 R >64/4 R * >4/76 R
A22 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R =2 S >8 R >64/4 R ≤2 S =4/76 R
A23 =16 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A24 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A25 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R =4 S =2/38 S A26 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A27 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R =2 S >8 R >64/4 R =4 S >4/76 R A28 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S =8 I >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R
A29 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R * >16 R >2 R * >8 R >8 R * >8 R >64/4 R * ≤1/19 S
A30 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S ≤2 S >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A31 >32 R >16/8 R =8 S >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S ≤2 S >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A32 >32 R >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A33 ≤8 S >16/8 R =16 I >32/8 R >32 R >16 R >2 R =12 R >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R A34 ≤8 S >16/8 R >16 R >32/8 R >32 R >16 R >2 R ≤1 S ≤2 S >8 R >4 R >8 R >64/4 R >8 R >4/76 R
A35 ≤8 S >16/8 R =16 I >32/8 R * >16 R >2 R * >8 R >8 R * >8 R >64/4 R * >4/76 R
R: Dirençli S: Duyarlı
I: Orta derece duyarlı
*: Çalışılmadı
46 Tablo-6: Pseudomonas izolatlarının MİK değerleri (μg/mL).
İZOLAT Amikasin Aztreonam Sefepim Sefoperazon sulbaktam Seftazidim Siprofloksasin Kolistin Gentamisin İmipenem Levofloksasin Meropenem Pierasilin tazobaktam
P1 ≤8 S =8 S >16 R =32/8 I >16 R =0.25 S ≤1 S >8 R >8 R =2 S >8 R =32/4 I
P2 >32 R >16 R >16 R >32/8 R =4 S >2 R * >8 R >8 R >8 R >8 R =64/4 I
P3 ≤8 S >16 R =16 I =32/8 I =8 S =1 S ≤1 S ≤2 S >8 R =4 I >8 R =32/4 I
P4 ≤8 S =16 I =8 S =16/8 S =4 S >2 R * =4 S >8 R * =8 R =8/4 S
P5 >32 R >16 R >16 R >32/8 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P6 ≤8 S >16 R >16 R >32/8 R >16 R >2 R ≤1 S ≤2 S >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P7 ≤8 S >16 R >16 R >32/8 R >16 R =0.5 S ≤1 S >8 R >8 R =2 S >8 R =32/4 I
P8 ≤8 S >16 R >16 R >32/8 R >16 R =1 S ≤1 S ≤2 S >8 R =4 I >8 R >64/4 R
P9 ≤8 S >16 R =16 I =32/8 I =8 S =1 S ≤1 S ≤2 S >8 R =4 I >8 R =16/4 S
P10 >32 R >16 R =16 I >32/8 R =8 S >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P11 ≤8 S >16 R =8 S >32/8 R =8 S ≤0.5 S ≤1 S ≤2 S >8 R =2 S >8 R =64/4 I
P12 =16 S >16 R =16 I >32/8 R =8 S ≤0.5 S ≤1 S =8 I >8 R =2 S >8 R =32/4 I
P13 =16 S >16 R >16 R >32/8 R >16 R ≤0.5 S ≤1 S >8 R >8 R ≤1 S >8 R >64/4 R
P14 ≤8 S >16 R =16 I >32/8 R >16 R =2 I ≤1 S ≤2 S >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P15 =16 S >16 R >16 R >32/8 R >16 R =2 I ≤1 S =8 I >8 R =4 I >8 R >64/4 R
P16 =32 I >16 R >16 R >32/8 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P17 ≤8 S =8 S =4 S =8/8 S =4 S ≤0.5 S ≤1 S ≤2 S >8 R ≤1 S =8 R =8/4 S
P18 =32 I >16 R >16 R * >16 R =2 I ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R
S: Duyarlı R: Dirençli
I: Orta derece duyarlı
*: Çalışılmadı
47 Tablo-6 (devamı): Pseudomonas izolatlarının MİK değerleri (μg/mL).
İZOLAT Amikasin Aztreonam Sefepim Sefoperazon sulbaktam Seftazidim Siprofloksasin Kolistin Gentamisin İmipenem Levofloksasin Meropenem Pierasilin tazobaktam
P19 ≤8 S >16 R >16 R >32/8 R =16 I >2 R ≤1 S =4 S >8 R >4 R >8 R =32/4 I
P20 >32 R >16 R >16 R >32/8 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P21 =32 I >16 R >16 R >32/8 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P22 =32 I >16 R >16 R >32/8 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R >8 R >64/4 R
P23 ≤8 S ≤2 S ≤1 S =32/8 I =2 S ≤0.125 S ≤1 S ≤2 S >8 R ≤1 S >8 R ≤4/4 S
P24 ≤8 S >16 R >16 R >32/8 R >16 R ≤0.5 S * >8 R ≤1 S * >8 R >64/4 R
P25 ≤8 S =4 S =4 S =16/8 S =4 S ≤0.5 S ≤1 S ≤2 S >8 R ≤1 S =4 I =8/4 S
P26 ≤8 S =8 S =8 S =16/8 S =8 S ≤0.5 S ≤1 S ≤2 S >8 R ≤1 S =4 I =32/4 I
P27 ≤8 S >16 R =16 I >32/8 R =8 S >2 R * >8 R ≤1 S * >8 R >64/4 R
P28 ≤8 S >16 R =16 I >32/8 R =8 S >2 R * >8 R =2 S * >8 R >64/4 R
P29 =32 I >16 R =16 I >32/8 R >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R >4 R =2 S >64/4 R
P30 =16 S >16 R >16 R >32/8 R >16 R ≤0.5 S * >8 R =4 I * >8 R =16/4 S
P31 ≤8 S =4 S =2 S =8/8 S =2 S >2 R ≤1 S ≤2 S >8 R >4 R =4 I ≤4/4 S
P32 ≤8 S =8 S >16 R >32/8 R >16 R =0.5 S ≤1 S >8 R =8 R =2 S >8 R =32/4 I
P33 =16 S >16 R =16 I =8/8 S >16 R >2 R ≤1 S =8 I =4 I >4 R >8 R =64/4 I
P34 =32 I >16 R >16 R =16/8 S >16 R >2 R ≤1 S >8 R >8 R * =8 R =16/4 S
P35 ≤8 S =8 S =2 S =8/8 S =2 S ≤0.125 S ≤1 S ≤2 S >8 R ≤1 S =8 R ≤4/4 S
S: Duyarlı R: Dirençli
I: Orta derece duyarlı
*: Çalışılmadı
48
Acinetobacter suşlarının 29’unda (%82,8) Etest, 16’sında (%45,7) MHT, 14’ünde (%40) ÇDST, 5’inde (%14,2) KDT ile MBL varlığı saptandı.
Etest ile MBL ürettiği belirlenen izolatların 13’ünde (%44,8) MHT ile de MBL pozitifliği gözlendi. Bu suşların sadece 4’ünde (%30,7) KDT ile 3’ünde (%23) ise ÇDST ile MBL varlığı saptandı. Tüm fenotipik testlerin birlikte MBL pozitifliği saptadığı hiçbir Acinetobacter suşuna rastlanmadı (Tablo-7).
Pseudomonas suşlarının 6’sında KDT (%17,1), 5’inde (%14,2) CAZ-MPA ÇDST, 4’ünde (%11,4) IMP-EDTA ÇDST, 2’sinde (%5,7) Etest, 1’inde (%2,8) MHT ile MBL varlığı saptandı. Etest ile imipenem MİK değeri <4 μg/mL bulunan 10 Pseudomonas izolatında değerlendirme yapılamadı. IMP-EDTA ÇDST, CAZ-MPA ÇDST ve KDT ile MBL pozitifliği saptanan 3 izolatın (P1,P7, P32) Etest sonuçları P7 ve P32 için pozitif, P1 için negatif bulundu (Tablo-8).
49
Tablo-7: Karbapenem dirençli Acinetobacter izolatlarının fenotipik ve genotipik test sonuçları.
*A. bau/calc complex: A. baumannii/calcoaceticus complex P: Pozitif
N: Negatif
50
Tablo-8: Karbapenem dirençli Pseudomonas izolatlarının fenotipik ve genotipik test sonuçları.
**Gastroent: Gastroenteroloji D: Değerlendirilemedi P: Pozitif N: Negatif
51
Fenotipik testler ile MBL pozitifliği saptanan suşlara ait görüntüler Şekil-10, 11,12 ve 13’te gösterilmiştir.