GEREÇ VE YÖNTEM

Çalı mada her biri ortalama 2600 ± 500 gr a ırlı ında toplam 50 adet albino di i ve erkek Angora tav anı kullanıldı. Tav anlar, nönü Üniversitesi Deneysel Ara tırma Merkezi’nden temin edildi. Çalı ma için nönü Üniversitesitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Etik Kurulu’ndan onay alındı. 12 saat gündüz ve 12 saat gece olacak ekilde 23˚C de deney ortamı hazırlandı. Tav anlar deneyden önce ve sonra tartıldı.

6.1. Yöntem

6.1.1 Deney Grupları

Çalı mada kullanılan toplam 50 adet tav an be gruba ayrıldı.

Grup 1: Lipidli TPN grubu: Bu gruptaki 10 adet tav ana santral venöz kateter yerle tirilip 10 gün lipidli TPN verildi. (Tablo VI)

Grup 2: Lipidsiz TPN grubu: Bu grupta ki 10 adet tav ana santral venöz kateter yerle tirilip 10 gün lipid içermeyen TPN verildi. (Tablo V)

Grup 3: Serum fizyolojik grubu: Bu gruptaki 10 adet tav ana santral venöz kateter yerle tirilip 10 gün 50 cc/kg/gün serum fizyolojik verildi.

Grup 4: Kateter grubu: Bu gruptaki 10 adet tav ana santral venöz kateter takılıp 10 gün bir tedavi verilmeksizin takip edildi.

Grup 5: Kontrol grubu: Bu grupta bulunan 10 adet tav ana herhangi bir i lem uygulanmadı.

6.1.2 TPN Modeli

Çalı ma sırasında gruplarda yer alan tav anların hepsinin a ızdan beslenmesine devam edildi ve su içmelerine izin verildi. Grup 1, Grup 2, Grup 3, ve Grup 4 teki tav anların internal juguler venlerine cut-down yoluyla kateter (venenkatheter 0.5×0.9 mm, 45 cm polyethylen kateter Braun Melsungen AG) yerle tirildi. lem ketamin (35 mg/kg M)

42

(ketalar, Parke-Davis, Ann Arbor, MI, USA) + ksilazin (5 mg/kg M) (Rompun, Bayer AG, Leverkusen, Germany) anestezisi altında gerçekle tirildi.(91)

TPN içeri indeki ürünler; %10 Intralipid® (Fresenius Kabi Uppsala sviçre), %6 Trophamin® _{(Eczacıba ı/BAXTER stanbul Türkiye), %20 Dekstroz}® _{(Eczacıba ı/BAXTER}

stanbul Türkiye), AddamelTM N (Fresenius Kabi Uppsala sviçre)’ den olu maktaydı.

Birinci ve ikinci gruptaki tav anlara kateter takıldıktan 1 gün sonra ba layarak 10 gün boyunca günde 8 saat sürekli infüzyon eklinde TPN uygulandı.(91)

Üçüncü gruptaki tav anlara kateter takıldıktan 1gün sonra 50cc/kg/gün serum fizyolojik 10 gün süresince günde 8 saat infüzyon eklinde verildi.

Tablo VI: Tav anlara uygulanan lipidli TPN’nun özellikleri.

Solüsyonlar Doz (g/kg/g) Volüm (ml) Enerji (kcal/g) Ozmolalite (mOsm/L) %6 TrophAmine 4 160 40 525 %20 Dextroz 18 250 170 1250 %10 ntralipid 2 50 55 280 %0.9 NaCl (3 mEq/kg) 50 - 310 KCl (3 mEq/kg) 3 - - Mg (1 mEq/kg) 1 - - Eser elementler - 1 - - Ca (1 mEq/kg) 1 Total TPN Karı ımı 516 365 825

Tablo V: Tav anlara uygulanan lipidsiz TPN’nun özellikleri.

Solüsyonlar Doz (g/kg/g) Volüm (ml) Enerji (kcal/g) Ozmolalite (mOsm/L) %6 TrophAmine 4 160 40 525 %20 Dextroz 18 250 170 1250 %0.9 NaCl (3 mEq/kg) 50 - 310 KCl (3 mEq/kg) 3 - - Mg (1 mEq/kg) 1 - - Eser elementler - 1 - - Ca (1 mEq/kg) 1 Total TPN Karı ımı 466 210 883

43

6.1.3 Doku örneklerinin alınması

Deney peryodu sonunda böbrek, karaci er ve vena kava inferior doku örnekleri alındı ve tav anlar sakrifiye edildi. Alınan dokular enine ikiye bölündü. Doku materyalleri %10’luk formolün içerisinde 24 saat fikse edilip parafin bloklara gömüldü. Parafin bloklardan 5 mikron kalınlı ında hazırlanan kesitler immünohistokimyasal yöntemlerle VCAM-1 ekspresyonu açısından de erlendirildi. mmünohistopatolojik inceleme nönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı labaratuarında iki patolog tarafından ve materyallerin hangi gruba ait oldu u bilinmeksizin yapıldı.

6.2. mmünohistokimyasal yöntem ve de erlendirme

Büyük çaplı damarları de erlendirmek için vena kava inferior, orta ve küçük çaplı venler de erlendirmek için böbrek ve karaci er dokularına bakılması amaçlandı. Formol ile fikse kesitlerde VCAM-1 ekspresyonunu göstermek için immünohistokimyasal boyama yapıldı. Poli-L-lisin kaplı lamlar kullanılarak hazırlanan kesitler 60˚C’de bir saat bekletildi. Sırasıyla 10’ar dakika ksilen, etanol ile muamele edildi. 1-2 dakika distile su ile yıkandı. Antijen geri kazanımı için ph’ı 8 olan EDTA tamponunda 20 dakika kaynatıldı. Daha sonra 20 dakika oda ısısında bekletildi. Fosfat tamponlu salinle (PBS) ile yıkandıktan sonra %3’lük hidrojen peroksit ile 10 dakika inkübe edildi. Daha sonra fosfat tamponlu salinle (PBS) ile tekrar yıkandıktan sonra U-V block ile muamele edildi. Daha sonra kesitler VCAM-1 antikorları (Rabbit Mouse monoclonal antiserum VCAM-1, Labvision, Fremont CA 94539, USA) ile 60 dakika oda sıcaklı ında inkübe edildi. Daha sonra 3 kere PBS ile yıkanan kesitler biotinylated goat antijen ile 20 dakika muamele edildi. Ardından 3 kere PBS ile yıkanan kesitler daha sonra streptavidin peroksidaz ile 20 dakika muamele edildi. 3 kere PBS ile yıkanan kesitlere AEC kromogen, damlatılıp 20 dakika bekletildikten sonra hematoksilen ile zıt boyama yapıldı. Daha sonra gliserin jel ile sulu kapatma yapıldı. Kesitler rastgele seçilen 20 bölgenin × 200 büyütmede incelenmesiyle de erlendirildi. mmünohistokimyasal boyanma dört evrede de erlendirildi; 0= boyanma olmaması, I= az boyanma olması, II= belirgin boyanma olması, III= yaygın boyanma olması eklinde evrelendi.(86)

6.3. statiksel analiz

Tüm verilerin ortalama ve standart hataları hesaplandı. Ortalamalar arasında anlamlı farklılıklar ANOVA analizi ile gruplar arası anlamlılık LSD (Least Significant Difference) analizi ile de erlendirildi. Tüm istatistiksel analizler SPSS programı kullanılarak yapıldı. (SPSS for windows; Chicago, IL, USA). P de erinin 0,05 ten küçük olması anlamlı olarak kabul edildi.

44

7. BULGULAR

Total parenteral beslenme uygulaması sonrası geli en vasküler endotelyal hasarı ara tırdı ımız bu çalı mada, elde etti imiz bulgular a a ıda sunulmu tur.

Tüm gruplardaki tav anların deney ba langıcındaki a ırlıkları (2600 ± 500 gr) ile ve bitimindeki (2550 ± 475) gr a ırlıkları arasında istatistiksel fark anlamlı de ildi. (p>0.05)

Karaci er doku kesitlerindeki küçük çaplı venlerde lipidli TPN grubu ve lipidsiz TPN grubunda kontrol grubuna göre VCAM-1 aktivitesinin belirgin olarak arttı ı saptanmı tır (sırasıyla 1.5±02 vs 0.1±01, 1.7±02 vs 0.1±01) (Resim 1) ( ekil 5). Bu artı istatistiksel olarak da anlamlı bulunmu tur (p<0.05). Aynı zamanda iki TPN grubunda elde edilen VCAM-1 aktiviteleri (sırasıyla 1.5±02, 1.7±02), kateter ve serum fizyolojik gruplarında elde edilen VCAM-1 aktivitelerine (sırasıyla 0.7±01, 0,0±00) göre yüksek bulunmu tur. (p<0.05) Serum fizyolojik grubunda hiç VCAM-1 aktivitesi saptanmazken, kateter grubunda (0.7±01) gibi dü ük bir aktivite bulunmu tur.

Karaci er doku kesitlerindeki küçük çaplı venlerde lipidli TPN grubundaki (Resim 1A) VCAM-1 aktivitesinin lipidsiz TPN grubu (Resim 1B) ile kıyaslandı ında (sırasıyla 1.5±02 vs 1.7±02) azalmı oldu u gözlendi. Ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. (p>0.05) ( ekil 5)

Böbrek doku kesitlerindeki küçük çaplı venlerde lipidli TPN grubu ve lipidsiz TPN grubunda kontrol grubuna göre VCAM-1 aktivitesinin belirgin olarak arttı ı saptanmı tır (sırasıyla 1.3±02 vs 0.1±01, 1.4±02 vs 0.2±01) (Resim 2) ( ekil 6). Bu artı istatistiksel olarak da anlamlı bulunmu tur (p<0.05). Aynı zamanda iki TPN grubunda elde edilen VCAM-1 aktiviteleri (sırasıyla 1.3±02, 1.4±02), kateter ve serum fizyolojik gruplarında elde edilen VCAM-1 aktivitelerine (sırasıyla 0.7±01, 0,0±00) göre yüksek bulunmu tur. (p<0.05) Serum fizyolojik grubunda hiç VCAM-1 aktivitesi saptanmazken, kateter grubunda (0.7±01) gibi dü ük bir aktivite bulunmu tur.

45

Böbrek doku kesitlerindeki küçük çaplı venlerde lipidli TPN grubundaki (Resim 2A) VCAM-1 aktivitesinin lipidsiz TPN grubu (Resim 2B) ile kıyaslandı ında (sırasıyla 1.3±02 vs 1.4±02) azalmı oldu u gözlendi. Ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. (p>0.05) ( ekil 6)

Vena kava inferior doku kesitlerinde lipidli TPN grubu ve lipidsiz TPN grubunda kontrol grubuna göre VCAM-1 aktivitesinin belirgin olarak arttı ı saptanmı tır (sırasıyla 1.5±02 vs 0.0±00, 2.0±02 vs 0.0±00) (Resim 3) ( ekil 7). Bu artı istatistiksel olarak da anlamlı bulunmu tur (p<0.05). Aynı zamanda iki TPN grubunda elde edilen VCAM-1 aktiviteleri (sırasıyla 1.5±02, 2.0±02), kateter ve serum fizyolojik gruplarında elde edilen VCAM-1 aktivitelerine (sırasıyla 0.7±01, 0,3±01) göre yüksek bulunmu tur. (p<0.05) Kontrol grubunda hiç VCAM-1 aktivitesi saptanmazken, kateter grubunda (0.7±01) ve serum fizyolojik grubunda (0.3±01) gibi dü ük aktivite bulunmu tur.

Bu kesitlerde lipidli TPN grubundaki VCAM-1 aktivitesinin lipidsiz TPN grubuna göre azalmı oldu u tesbit edildi (sırasıyla 1.5±02 vs 2.0±02) ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı de ildi. (Resim 3A-3B) ( ekil 7). (p>0.05)

Total parenteral beslenme üzerine yaptı ımız bu çalı mada saptanan bulgular, TPN’nin küçük, orta ve büyük çaplı venlerde belirgin endotel hasarına yol açtı ını göstermektedir. TPN içeri indeki lipidin, istatistiksel olarak anlamlı olmasa da bu hasarı kısmen azalttı ı görülmü tür.

46 1.5±02*,& 1.7±02 0.7±01 0.1±01 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

grup 1 grup 2 grup 3 grup 4 grup 5

ekil 5. Grupların karaci er dokularındaki küçük çaplı venlerin endotelindeki ortalama VCAM-1