3.1.1. Vakaların Oluşturulması ve Gruplama
Deneysel çalışmamızda, Sprague-Dawley, dişi, ortalama ağırlıkları 150-200 gr olan toplam 6-7 haftalık 48 adet rat kullanıldı. (Ratlar deney öncesi bir hafta süre ile tel kafeslerde 12 saat gece 12 saat gündüz sirkadiyan ritm de, ortam sıcaklığı 24-26 °C ve nem oranı %50-60 olacak şekilde tutuldu).
Tüm cerrahi prosedürler ratlara intraperitoneal ketaminhidroklorür (50mg/kg)+ksilazin HCL 5 mg/kg ile anestezi uygulandıktan sonra gerçekleştirildi. Sham operasyonu yapılan grup hariç tüm gruplarda anestezi altında No:16 branül ile batına girilip CO2 insuflasyonu gruplarda belirtildiğine göre uygun olarak uygulandı.
Gruplar sekizer (n=8) sayıda rattan oluşturularak aşağıda belirtilen şekilde düzenlendi.
• Grup 1 (kontrol). Aneztezi altında 60 dakika bekletildi.
• Grup 2 (Đ/R). Anestezi altında 60 dakika 15 mmHg CO2 insuflasyonu uygulanıp ve bu uygulamanın desüflasyon ile sonlandırılmasını takiben 20 dakikalık desüflasyon süresi takip edildi.
• Grup 3 (Plasebo-Serum fizyolojik+Đ/R). Anestezi altında 60 dakika 15 mmHg CO2 insuflasyonu uygulandı. Đnsüflasyonun başlangıcından 5 dakika sonra kuyruk veninden izotonik verildi. Đnsüflasyonun desüflasyon ile sonlandırılmasını takiben 20 dakikalık desüflasyon süresi takip edildi.
• Grup 4 (Aprotinin+Đ/R). Anestezi altında 60 dakika 15 mmHg CO2 insuflasyonu uyguladı. Đnsüflasyonun başlangıcından 5 dakika sonrasında Aprotinin 30,000 KIU/kg/0,7 mL dozunda kuyruk veninden uygulandı. Đnsüflasyonun desüflasyon ile sonlandırılmasını takiben 20 dakikalık desüflasyon süresi takip edildi
• Grup 5 (Aprotinin+Kademeli basınç Kombinasyonu+Đ/R). Anestesi altında önce 10 dakika 5 mmHg CO2 insuflasyonu, sonrasında 10 dakika 10 mmHg CO2 insuflasyonu, sonrasında 60 dakika 15 mmHg CO2 insuflasyonu uygulandı.
dozunda kuyruk veninden uygulandı. Đnsuflasyonun desüflasyon ile sonlandırılmasını takiben 20 dakikalık desüflasyon süresi takip edildi.
3.1.2. Numunelerin Alınması ve Doku Analizi Ön Đşlemleri
Grup 1 60 dakikalık anesteziyi takiben ve diğer gruplar (Grup 2-3-4-5) ise reperfüzyon bitiminde intrakardiyak kan alımı sonrası servikal dislokasyon ötenazisi uygulanarak süratle böbrek dokusu biyokimyasal analizler için alındı.
Đntrakardiyak olarak alınan kan süratle santrifuj edilip elde edilen plazma biyokimyasal analizlerle ilgili olarak plastik ependorf kapaklı tüplere transfer edildi. Servikal dislokasyonu takiben alınan dokular ise; serum fizyolojikle yıkanarak kan, pıhtı ve komşu doku artıklarından arındırıldıktan sonra histopatolojik ve biyokimyasal analizlere uygun saklama kaplarına (biyokimyasal analizler için plastik ependorf kapaklı tüplere ve patoloji analiz için formol içine) transfer edildi. Biyokimyasal analizlerle ilgili plazma ve doku numuneleri ependorf kapaklı plastik tüplerde -80 0C’ye derin dondurucuya aktarıldı.
Malonil dialdehit (MDA), ksantin oksidaz (XO), superoksit dismutaz (SOD), adenozin deaminaz (ADA), ürik asit, TNF-alfa ve IL-6 gibi Đ/R hasarı ile ilişkili biyokimyasal parametrelerin doku örnekleri analiz öncesinde soğuk zincire dikkat edilerek homojenize edildi. Homojenizasyonu takiben protein, MDA, XO, SOD ve AOA analizleri çalışıldı.
3.1.3. Kullanılan Cihazlar
a. Homojenizatör : Misonix XL 2007 Ultrasonic Cell Disruptor, USA b. Soğutmalı santrifüj : Hettich Universal 30 RF
c. Spektrofotometre : Shimadzu UV - 1601 d. Ayarlanabilir otomatik pipetler
e. Vorteks f. Benmari g. Hassas terazi
h. Manyetik karıştırıcı ve manyetik bar i. Damıtma cihazı
3.1.4. Kullanılan Reaktif ve Çözeltiler
Lowry Metodu reaktifleri
A reaktifi: 0,5 gr CuSO4.5H2O ve 1 gr Na3Sitrat (susuz) 100 ml distile suda çözülür.
B reaktifi: 20 gr Na2CO3 ve 4 gr NaOH, 1 L distile suda çözülür C reaktifi: 50 ml B çözeltisine 1 ml A çözeltisi ilave edilir D reaktifi: Phenol - Folin – Ciocalteu reaktifi
SOD (Süperoksit Dismutaz) reaktifleri Assay Reaktifleri;
a. 0,3 mmol / L Xanthine b. 0,6 mmol / L EDTA c. 150 µmol / L NBT d. 400 mmol / L Na2CO3
e. 1 g / L bovine serum albumin
Đlk 5 kimyasalın sırasıyla karıştırılması ile ASSAY reaktifi hazırlanır f. 0,8 mmol / L CuCl2
g. 2 M (NH4)2SO4
h. 167 U / L Ksantin Oksidaz i. 150 mM NaCN
XO (Ksantin Oksidaz) reaktifleri
a. Fosfat tamponu (50 mM, pH 7,5 – 0,5 mM Na2 EDTA’lı) b. 4 mM Ksantin
c. TCA (%100 w / v)
MDA ( Malondialdehit) reaktifleri a. % 0,675’lik TBA çözeltisi
b. %10’luk TCA
AOA (Antioksidan Aktivite) reaktifleri a. Fosfat tamponu (100 mM, pH 7,4) b. 10 mmol/l Sodyum Benzoat c. 50 mmol/l NaOH
d. 100 mM pH 7,4 fosfat tamponu ile hazırlanmış 2 mmol/l EDTA e. 2 mmol/l Fe(NH4)2(SO4)2
f. 10 mmol/l H2O2 g. % 20’lik asetik asit
h. 10 mmol/L Sodyum Benzoat ile hazırlanmış %0,8 lik TBA i. 5 mmol/l NaOH içinde hazırlanmış 1 mmol/l Ürik asit
NO (Nitrik Oksit) reaktifleri
Kadmiyum Granülleri
Glisin-NaOH Tamponu (Ph=9,7) Sülfanilamid
N-Naphthylethene daimine (NNDA) 5 mmol/L CuSO4
0,1 mol/L H2SO4 0,1 mol/L NaNO2 75 mmol/L ZnSO4 55 mmol/L NaOH
ADA (Adenozin Deaminaz) reaktifleri
Fosfat tamponu pH 6.5, 50 mM Adenozin tamponu pH=6.5, 20 mM
Amonyum Sülfat standart solusyonu (75 µM)
Alkali hipoklorid solüsyonu (11 mM NaOCl, 125 mM NaOH)
Fenol nitroprussid Solüsyonu (106 mM (P), 0,17 mM (Na-Nitroprussid)
3.2. Yöntem
3.2.1. Dokuların Homojenizasyonu
Analiz gününe kadar – 800 C de saklanan dokular, çalışma günü derin dondurucudan çıkarılıp kuru buz ortamında laboratuara getirildi ve analiz öncesinde çözüldü.
Cam tüpe aktarılan yaklaşık 0,30-0,50 gramlık doku üzerine 2 ml Tris – HCl tamponu eklendi. Buz doldurulmuş plastik kap içerisine yerleştirilen cam tüpteki doku tam bir homojenizasyon sağlanıncaya kadar yaklaşık olarak 2-5 dakika süreyle ultrasonik homojenizatörde homojenize edildi. Bu süre içerisinde son hacim doku ağırlığının 10 katı olacak şekilde tampon ilaveleri yapıldı. Homojenattan MDA çalışması için yeterli olacak kadar numune alındıktan sonra kalan homojenat +40 C de 30 dakika süre ile santrifüj edildi. Supernatandan XO, AOA ve protein analizleri için yeterli olacak kadar miktar alındıktan sonra kalan supernatanlar eşit hacimde 3/5 oranında hazırlanan Kloroform/Etanol karışımı ile vortexlenip cam tüpte 3220 rpm / 40 dakika +4 oC’de santrifüj edildi. Üstte oluşan etanol fazından protein ve SOD enzim aktivite tayini yapıldı.
3.2.2. Protein Ölçümü
Proteinlerin ölçümü Lowry ve ark (1951)’nın metoduna göre yapıldı. Alkali çözeltide bakır – protein kompleksi oluşmaktadır. Bu kompleks Folin – Ciocalteu – Phenol reaktifini redükler ve koyu mavi bir renk oluşturur. Buradaki renk koyuluğu ortamdaki protein konsantrasyonuyla doğru orantılıdır.
Protein ölçümü için değişik konsantrasyonlarda hazırlanmış olan protein standart solüsyonlarından faydalanılarak bir standart grafiği elde edildi. Çalışmalar için kör ve numune tüpleri hazırlandı. Numune tüpüne 10 µl numune ile 490 µl distile su ve kör tüpüne 500 µl distile su koyulduktan sonra üzerlerine 2,5 ml C reaktifi eklenip 10 dakika oda ısısında bekletildi. Tüplere 250’şer µl D reaktifi koyulup hızla vortekslendi. 30 dakika oda ısısında bekletildi. Bekleme süresinin sonunda 700 nm’de köre karşı absorbanları alındı. Sonuçlar standart grafiğinden hesaplandı.
3.2.3. MDA (Malondialdehit) Ölçümü
MDA seviyeleri Hammouda ve ark (1995)’nın metodu ile tiobarbitürik asit (TBA) reaktivitesi yöntemi kullanılarak ölçüldü. Yağ asidi peroksidasyonunun bir ürünü olan MDA, TBA ile reaksiyona girerek sıcak ve alkali ortamda, 532 nm’de maksimum absorbans veren renkli kompleks oluşturur. Oluşan kompleksin okunan absorbansından faydalanılarak MDA değerleri elde edilir.
Numune ve deney tüpleri hazırlandı. Tüplere 2,5 ml % 10’luk (w/v) TCA çözeltisi koyulduktan sonra kör tüpüne 0,5 ml distile su, numune tüpüne ise 0,5 ml numune koyularak vorteksle karıştırıldı. Tüplerin ağzı kapatıldıktan sonra 900 C’lik su banyosunda 15 dakika bekletildi. Tüpler soğutulduktan sonra 3000 x g de 10 dakika santrifüj edildi. Supernatanlardan 2 ml alınıp üzerine % 0,675’lik (w/v) TBA çözeltisinden 1 ml eklendi. Tekrar 90 0C’lik su banyosunda 15 dakika bekletildikten sonra tüpler soğutuldu. Her numunenin 532 nm de köre karşı absorbansları okutuldu.
1,1,3,3-tetramethoxypropane’nın değişik konsantrasyonları ile hazırlanan Standart grafiğinden faydalanılarak nmol/ml olarak hesaplanan MDA düzeyleri nmol / gr yaş doku cinsinden ifade edildi.
3.2.4. XO (Ksantin Oksidaz) Ölçümü
XO aktivitesi Prajda ve ark (1975)’nın metoduna göre çalışıldı. Bu metotta XO aktivitesi; numunede bulunduğu farz edilen XO’ın ortamdaki ksantinden ürik asit oluşturması esasına dayanır. Oluşan ürik asit miktarı % 100’lük TCA solüsyonunun eklenmesi ile sabitlenir.
Her bir numune için ayrı ayrı olacak şekilde numune ve kör tüpleri hazırlandı. Tüm tüplere EDTA’lı fosfat tamponundan 1680 µL ve Ksantin solüsyonundan 30 µL pipetlendi. Ardından numune tüplerine 30’ar µL numuneler pipetlendi. 37˚C'de 30 dakika inkübasyonun arkasından numune tüplerindeki reaksiyon 84 µL TCA ilavesi ile durduruldu. Kör tüplerine de önce 30’ar µL numune ve hemen beklenmeden 84 µL TCA pipetlenip vortekslendi. 4000 x g’de 20 dakika santrifüj sonu süpernatanların 293 nm dalga boyunda distile suya karşı absorbansları okundu. Böylece 30 dakika içerisinde üretilen ürik asit miktarı belirlendi ve sonuçlar ürik asitin değişik konsantrasyonları ile hazırlanan standart grafiğinden faydalanılarak aktivite U/gr protein cinsinden ifade edildi.
H2O + O2 Ksantin Oksidaz H2O2
Ksantin Ürik asit
3.2.5. SOD (Süperoksit Dismutaz) Ölçümü
Süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi; Sun ve ark (1988) ve Durak ve ark (1992)’nın tariflediği modifikasyona göre analiz edildi. Tayin metodu: ksantin / ksantin oksidaz sistemi ile üretilen süperoksitin nitro blue tetrazoliumu (NBT) indirgenmesi esasına dayanır. Oluşan süperoksit radikalleri ortamdaki NBT’yi indirgeyerek renkli formazon oluşturur. Bu kompleks 560 nm’de maksimum absorbans verir. Enzimin olmadığı ortamda bu indirgenme meydana gelip mavi – mor renk oluşmaktadır. Ortamda SOD olduğunda ise NBT indirgenmesi olmayıp mavi – mor renk meydana gelmemekte ve enzim miktar ve aktivitesine bağlı olarak açık renk oluşmaktadır.
Kör ve numune tüpleri hazırlandı. Tüm tüplere 1425 µL ASSAY reaktifinin ardından numune tüplerine 50 µL ekstrakt (Etanol fazı) ve kör tüpüne 50 µL distile su pipetlendi. Tüm tüplere 25’er µL XO enzimi ilavesi ile tüpler alt üst edilip 25º C'de 20 dakika inkübasyon sonu hemen tüm tüplere 500’er µL CuCl2 ilavesi ile reaksiyonlar durduruldu. Distile suya karşı körden başlanarak 560 nm de absorbansları okundu.
Enzim olmayan (kör) değer ile enzim bulunan numune absorbans değerleri hesaba katıldı. Hesaplama;
Enzimin % inhibisyonu = ( Abskör – Absnum) / (Abskör x 100)
Bir SOD ünitesi; NBT redüksiyonunu % 50 oranında inhibe eden enzim aktivitesidir. %50 inhibisyonu gerçekleştiren enzim aktivitesi U/L olarak hesaplandıktan sonra mg protein değerine bölünerek, U/mg protein değerine çevrilir.
3.2.6. AOA (Antioksidan Aktivite) Ölçümü
Bu parametre Koracevic ve ark (2002)’nın metoduna göre çalışıldı. Buna göre; Fe-EDTA komplexinden oluşan standart bir solüsyon Hidrojen peroksit ile Hidroksil radikallerinin oluşumuna neden olan fenton tipi bir reaksiyon verir. Bu reaktif oksijen türleri salınımı ile sonuçlanan TBARS (tiobarbiturik asit reaktif substansları) benzoatı azaltırlar. Eklenen homojenattaki antioksidanlar TBARS oluşumunu baskılarlar. Bu reaksiyon spektrofotometrik olarak ölçülür ve bu renk oluşumunun inhibisyonu AOA’ yı tanımlar.
Kör, standart ve numunelerin her biri için 1 ve 0 ile işaretli olmak üzere cam tüpler etiketlendi. Numune tüplerine numuneler standart tüplerine ürik asit standartı 10’ar µL pipetlendikten sonra aynı tüplere 490 µL distile su pipetlendi. Kör tüplerine ise 500’er µL distile su pipetlendi. Tüm tüplere 500’er µL sodyumbenzoat ilavesinin ardından 0 ile etiketli tüplere 1’er ml asetik asit eklendi. Ardından tüm tüplere 200’er µL Fe-EDTA ve 200’er µL H2O2 pipetlenip 60 dakika için 37 0C de bekletildi. Sürenin bitimini takiben bu kez 1 ile etiketli tüplere 1’er ml asetik asit ilavesinin ardından tüm tüplere 1’er ml TBA eklenip kaynar su banyosunda 10 dk bekletildi. Sürenin sonunda buzlu su ile soğutulup tüm tüplerin 532 nm de distile suya karşı absorbansları alındı.
Sonuçlar AOA (nmol/mg protein) = (CUA) x (K – A) / (K – UA) formülünden faydalanılarak mg protein başına antioksidan aktivite olarak hesaplandı.
CUA : Ürik asit standartının konsantrasyonu K : K1-K0
A : A1- A0 UA : UA1 – UA0
3.2.7. NO (Nitrik Oksit) Ölçümü
Nitrik oksit, üretildiği bölgede saniyeler içinde okside olarak önce nitrite (NO2-) daha sonra da nitrata (NO3-) dönüşmektedir. Bununla beraber proteinden zengin solüsyonlarda ve vücut sıvılarında spesifik olmayan reaksiyonlar meydana gelebileceğinden dolayı Griess reaksiyonu ile ölçümlerde bazı sıkıntılar yaşanabilmektedir. Bu nedenle nonspesifik reaksiyonların önüne geçebilmek amacıyla numuneler önce deproteinize edilip daha sonra total nitrit (nitrit ve nitrat) seviyeleri ölçüldü. NO analizi Griess reaksiyonu ile belirlendi (Cortas ve Wakid 1990).
15 ml’lik plastik tüplerin içine 2,5 gr kadmiyum ve 3ml H2SO4 hazırlanması çalışma öncesinde yapıldı. Daha sonra kadmiyumlar üç defa distile su yıkandı ve ardından plastik distile su kabının uç kısmı eğilerek tazyikli bir şekilde yıkama yapılarak kurulama işlemi süzgeç kağıdı ile yapıldı. Bu işlemde kadmiyumlarım iyice kurutulmasına ve zayi olmamasına özen gösterildi. Daha sonra 2 ml CuSO4 ilavesi yapıldı ve ardından vortekslendi. Süzülerek dökülüp tekrar kurulama işlemi yapıldı. 2 ml Glisin tamponu ilave edilip vortekslendi ve ardından dökülüp tekrar kurulandı. Daha sonra numune hazırlanmasına geçildi.
Đkinci aşama olarak diğer taraftan parmak tüpler hazırlandı 160 µL Homojenat + 640 µL ZnSO4, 800 µL NaOH sırayla eklendi ve ardından hemen vortekslenerek 3500 rpm de 10 dakika santrifuje edildi.
Üçüncü aşama olarak nitrat tayinine geçildi. Bu aşamada glisin tamponu ile yıkanmış aktif kadmiyum granüllü tüplerin üzerine 1 ml glisin tamponu ilave edildi.
Yine bu tüplerin üzerine 1 ml deproteinize numune ilave edilip ardından 2 ml distile su ilave edildi. Plastik tıpa ile kapatılıp karanlık bir ortama bırakıldı. Her 10 dakikada bir bu kadmiyumlu tüpler alt üst edildi. Bu işlem 90 dakika boyunca devam ettirildi.
Đnkubasyon sonunda nitrit çalışma çizelgesine göre uyularak sırasıyla numune ve reaktifler konuldu.
Çizelge 3.1. NO çalışma çizelgesi
Kör Numune veya standart
Numune - 2 ml
Distile su 2,5 ml 0,5 ml
Sulfanilamid 1 ml 1 ml
N-naptyletilendiamin 1 ml 1 ml
Bu işlemler tamamlandıktan sonra 50 dakika oda ısısında bekletildi. Total nitrit (nitrit + nitrat) konsantrasyonu modifiye kadmiyum redüksiyon metodu ile değerlendirilerek reaksiyon sonucu oluşan pembe rengin 545 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunması ile sonuçlar mikromol/g protein olarak belirlenir.
3.2.8. Adenozin Deaminaz ( ADA) enziminin aktivite tayini
Numune substrat olan adenozin ile 37 0C’de bir saat inkube edilmiş ve oluşan
amonyak alkali ortamda sodyum hipoklorit ve fenol ile mavi indofenol oluşturmuştur. Amonyak konsantrasyonu direkt indofenolün absorbansıyla doğru orantılıdır (Giusti 1974). ADA ölçümüne ait işlem basamakları Çizelge 3.2 ve Çizelge 3.3’te gösterilmiştir.
Çizelge 3.2. ADA ölçümünde işlem basamakları-I
Hazırlanacak Deney Tüpleri Kullanılan
çözeltiler
Reaktif körü Standart Adenozin körü Numune körü Numune Fosfat tamponu 1 mL - - 1 mL - Adenozin - - 1 mL - 1 mL
Çizelge 3.2. ADA ölçümünde işlem basamakları-I (devamı)
Amonyum
Sülfat - 1 mL - - -
Numune - - 50 µL 50 µL
Distile Su 50 µL 50 µL 50 µL - -
Numune ve diğer tüpler Çizelge 3.2’de gösterildiği şekilde hazırlanarak pipetleme yapılmıştır. Deney tüpleri vortekslenerek 37 oC’da 1 saat su banyosunda bekletilmiş ve Çizelge 3.3’de gösterilen diğer işlemlere geçilmiştir.
Çizelge 3.3. ADA ölçümünde işlem basamakları-II
Hazırlanacak Deney Tüpleri Kullanılan
çözeltiler
Reaktif körü Standart Adenozin körü Numune körü Numune Fenol- nitroprussid 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL Alkali hipoklorit 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL
Pipetleme bittikten sonra her tüp, diğerine geçmeden muhakkak karıştırılmalı ve; 37 oC’ da 30 dakika su banyosunda bekletildikten sonra 625 nm’de distile suya karşı spektrofotometrede okunmuştur. Hesaplamada; numune, adenozin ve reaktif körlerinin absorbansları dikkate alınarak numunenin net absorbansı hesaplanmıştır. Standart konsantrasyonu ve dilüsyon faktörü de dikkate alınarak numunedeki enzim aktivitesi U/gr protein olarak hesaplanmıştır.
3.2.9. Ürik Asit (UA) analizi
Randox enzimatik kolorimetrik kiti ile (cat no: UA 233) ürik asit seviyeleri çalışıldı. Bu yöntemin çalışma prensibi olarak; Ürik asitin allontoin ve hidrojen perokside çevrilmesi esastır. Hidrojen peroksit, peroksidaz enzimin katalitik etkisi altında 3,5-Dikloro 2-hidroksibenzenosülfonik asit ve 4-aminophenazone kırmızı violet
görünümlü quinonemine çevrilir. Bu renkli bileşik 520 nm dalga boyunda okunur. Sonuçlar nmol/mg protein cinsinden verilir (Fossati ve ark 1980).
3.2.10. Tümör Nekroz Faktör Alfa(TNF-α) Analizi
Rat serumlarındaki TNF-α düzeylerinin ölçümü; sandwich enzimi immunoassay (ELISA) pensibine dayanan Bio Source firmasının rat TNF-α (California, USA, Catalog // KRC3011) kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar pg/mL cinsinden verilmiştir.
3.2.11. Đnterlökin 6 (IL-6) Analizi
Rat serumlarındaki IL-6 düzeylerinin ölçümü; sandwich enzimi immunoassay (ELISA) pensibine dayanan Bio Source firmasının rat IL-6 (Bio Source, KRC0061, 1 plate, California, 93012 USA) kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar pg/mL cinsinden verilmiştir.