Geliştirilmiş Neubauer Hemositometre

APÊNDICE A. FRACIONAMENTO PROPOSTO POR HEDLEY ET AL. (1982)

Os passos do fracionamento segundo Hedley et al, (1982), estão descritos a seguir, mais detalhes podem ser obtidos em Gatiboni (2003):

Primeira extração:

- pesar 0,5 gramas de solo em tubo de centrífuga com tampa rosca; - adicionar 10 ml de água destilada;

- adicionar 1 lâmina de resina RTA (recuperada através de lavagem com HCl 0,5 mol L-1 _{e carregada com NaHCO}

3 0,5 mol L-1, lavando o excesso com água);

- agitar por 16 horas em agitador horizontal (220 rpm); - retirar a RTA do tubo com auxílio de uma pinça;

- lavar o excesso de solo da RTA com jato d'água destilada;

- colocar a RTA em recipiente com tampa contendo 15 ml de HCl 0,5 mol L-1; - deixar em repouso por 90 min (com a tampa aberta);

- agitar por 30 min em agitador horizontal; - retirar a RTA com auxílio de pinça;

- centrifugar o solo + água à 6000 rpm por 15 min e descartar o sobrenadante; - determinar Pi no extrato de HCl 0,5 mol L-1, por Murphy & Riley (1962) Segunda extração:

- agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; - agitar por 16 horas em agitador horizontal;

- centrifugar à 6000 rpm por 15 min;

- reservar o sobrenadante para análise de Pi e Pt;

- adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol L-1 com cuidado para não mexer o solo; - centrifugar à 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato; - determinar Pi no extrato de bicarbonato, por Murphy & Riley (1962)

- digerir uma alícota com 10 mL de persulfato de amônio 7,5% e 1 mL de H2SO4

1:1, em autoclave a 121 °C por duas horas;

- determinar Po no extrato digerido, por Murphy & Riley (1962), diferença entre o P do extrato digerido e Pi determinado anteriormente.

Terceira extração:

- na mesma amostra, adicionar 10 ml de NaOH 0,1 mol L-1; - agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; - agitar por 16 horas em agitador horizontal;

- centrifugar à 6000 rpm por 15 min;

- reservar o sobrenadante para análise de Pi e Pt;

- adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol L-1 com cuidado para não mexer o solo; - centrifugar à 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato

anterior;

- determinar Pi no extrato, por Murphy & Riley (1962)

- digerir uma alícota com 10 mL de persulfato de amônio 7,5% e 1 mL de H2SO4

1:1, em autoclave a 121 °C por duas horas;

- determinar Po no extrato digerido, por Murphy & Riley (1962), diferença entre o P do extrato digerido e Pi determinado anteriormente.

Quarta extração:

- na mesma amostra, adicionar 10 ml de HCl 1,0 mol L-1; - agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; - agitar por 16 horas em agitador horizontal;

- centrifugar à 6000 rpm por 15 min;

- adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol L-1 com cuidado para não mexer o solo; - centrifugar à 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato

anterior;

- determinar Pi no extrato, por Murphy & Riley (1962) Quinta extração:

- adicionar 10 ml de NaOH 0,5 mol L-1;

- agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; - agitar por 16 horas em agitador horizontal;

- centrifugar à 6000 rpm por 15 min;

- reservar o sobrenadante para análise de Pi e Pt;

- adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol L-1 com cuidado para não mexer o solo; - centrifugar à 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato

anterior;

- digerir uma alícota com 10 mL de persulfato de amônio 7,5% e 1 mL de H2SO4 1:1, em autoclave a 121 °C por duas horas;

- determinar Po no extrato digerido, por Murphy & Riley (1962), diferença entre o P do extrato digerido e Pi determinado anteriormente.

Digestão final:

- secar o solo em estufa à 50° C

- pesar 0,1g do solo restante em tubo de digestão;

- adicionar 2 ml de HCl, 1 ml de HNO3 e 1,5 ml de H2SO4 (P,A,);

- aquecer em bloco digestor até 150º C, até clarear; - deixar por mais meia hora;

APENDICE B. FÓSFORO NA BIOMASSA MICROBIANA (Hedley & Stewart, 1982; Reinheimer, 2000)

Procedimento de análise:

a) Incubar o solo com umidade equivalente a 80% da CC por 30 dias à temperatura ambiente b) pesar 0,5 gramas de solo úmido, em triplicata (conjuntos a, b, c), para tubo de centrífuga com tampa rosca;

c) adicionar 10 ml de água destilada;

d) adicionar 1 lamina de RTA limpa e recuperada;

e) agitar por 16 horas no "end-over-end" (rotação de 33 rpm);

f) retirar a RTA do tubo com auxílio de uma pinça (pode-se medir o Pi desta resina) j) centrifugar o tubo a 6000 rpm por 15 minutos e descartar o sobrenadante;

k) no conjunto A, adicionar 0,5 ml de CHCl3 conc. e nos conjuntos B e C 0,5 ml

de H2O dest.;

l) deixar o solo em repouso por 24 horas;

m) Nos conjuntos A e B adicionar 10 ml de NaHCO3 0,5 mol L-1 e no conjunto C adicionar 10

ml de NaHCO3 0,5 mol L-1 + 50 mg L-1 de P;

n) agitar por 16 horas no “end-over-end”

o) centrifugar à 6000 rpm por 15 min e reservar o sobrenadante para análise; p) determinar o Pi dos 3 conjuntos por Murphy & Riley (1962).

APENDICE C. ATIVIDADE DE FOSFATASES ÁCIDAS (Eivazi & Tabatabai, 1977)

Soluções:

MUB pH 6,5: Em um Becker de 1000 ml, adicionar 12,1 g de TRIS, 11,6 g de ácido malêico, 14 g de ácido cítrico e 6,3 g de ácido bórico. Adicionar 500 ml de NaOH 1 mol l-1 e ajustar o pH para 6,5 com HCl. Transferir para balão volumétrico de 1000 ml e ajustar o volume com água destilada.

p-nitrofenyl fosfato: Adicionar 1,927 g de p-nitrofenyl fosfato disódico tetrahidratado em um balão volumétrico de 50 ml e completar o volume com MUB (preparar no momento do uso).

CaCl2 0,5 mol L-1: Pesar 55,5 g de cloreto de cálcio, transferir para balão de 1000 ml e

completar o volume com água destilada.

NaOH 0,5 mol l-1: Pesar 20,00 g de NaOH, transferir para balão de 1000 ml e completar o volume com água destilada.

Tolueno.

Procedimento de análise:

a) Incubar o solo com umidade equivalente a 80% da CC por 30 dias à temperatura ambiente; b) pesar 1 g de solo úmido para erlenmeyers de 50 ml com rolha de silicone;

c) em capela de exaustão, adicionar 1 ml da solução de p-nitrofenyl fosfato + 4 ml de MUB + 0,25 ml de tolueno e tampar o erlenmeyer;

c) incubar por 1 hora a 37 °C no escuro;

d) adicionar 1 ml de CaCl2 0,5 mol L-1 + 4 ml de NaOH 0,5 mol L-1 e agitar manualmente;

e) filtrar com Whattman 2v;

f) ler a absorbância no fotocolorímetro em 400 nm.

Para regulagem do aparelho, construir uma curva utilizando p-nitrofenol (para síntese), e submete-la aos passos "c" a "f", exceto a adição de p-nitrofenyl fosfato.

p-nitrofenol (µg g-1 solo seco h-1) = C*V/Ss*Su*t onde,

C = concentração de p-nitrofenol (µg ml-1 filtrado); V = volume da suspensão (em ml);

Ss = quantidade de solo seco incubada; Su = quantidade de solo úmido utilizada (1 g); t = tempo de incubação (1 hora).