Geliştirilmiş Neubauer Hemositometre

Geliştirilmiş Neubauer hemositometresi; her biri cama kazılmış 3 x 3 mm karelerden oluşan iki sayma alanına sahiptir. Karelerin üzerine 0,44 mm kalınlıkta

özel bir lamel kapatılır. 100 µm derinliğe sahip olan bu kamaranın sayma alanlarının her biri dokuz tane 1 x 1 mm’lik karelere bölünmüştür.

Şekil 3.2. Geliştirilmiş Neubauer hemositometre sayım alanları.

1, 3, 7 ve 9 numaralı dört büyük kare; her birinin hacmi 6,25 nl sıvı tutan 4 karelik 4 sıradan oluşur. 2 ve 8 numaralı iki büyük kare; her birinin hacmi 5 nl sıvı tutan 5 karelik 5 sıradan oluşur. 4 ve 6 numaralı iki büyük kare; her birinin hacmi 5 nl sıvı tutan 4 karelik 5 sıradan oluşur. Ortada yer alan 5 numaralı büyük kare ise her birinin hacmi 4 nl sıvı tutan 5 karelik 5 sıradan oluşur. Toplamda 1 x 1 mm’lik 9 tane büyük kareye bölünen bu kamara sisteminin her bir büyük karesinin hacmi 100 nl’dir. Sayım yapılacak olan alanlar semenin seyreltme oranı ve sperm sayısına göre belirlenir (WHO, 2010). Buna göre;

• Likefiye olmuş, iyice karıştırılarak homojenize edilmiş ve seyreltilmemiş semen numenesinden pipet yardımı ile 10 µl alınarak lam üzerine alındı ve üzerine 22 x 22 mm’lik lamel hava kabarcığı kalmayacak şekilde kapatılarak, 20 µm derinlikte olan ıslak preparat hazırlandı.

• Hazırlanan preparat faz kontrast mikroskobunun 40X objektifi altında incelemeye alındı.

• Tablo 3.1’de yer alan sperm sayılarına göre uygun olan dilüsyon oranı belirlendi.

Tablo 3.1. Islak preparattaki sperm sayısına göre belirlenen dilüsyon oranları. 40X Objektifte

görme alanı başına düşen sperm oranı

Dilüsyon oranı Semen µl Dilüent µl Swim up 1+1 (1:2) 100 100 <15 1+4 (1:5) 100 400 15-40 1+9 (1:10) 50 450 40-200 1+19 (1:20) 50 950 > 200 1+49 (1:50) 50 2450

• Gerekli dilüsyon oranının sağlanabilmesi için dilüent denilen, semeni seyreltici fiksatif kullanıldı.

• Bu fiksatif, 1000 ml saf su içinde 50 g sodyum bikarbonat (NaHCO3) ve 10 ml % 35 formalini çözerek hazırlandı ve 4◦C’de saklandı.

• Sayım yapılacağı zaman semen iyice karıştırıldı ve dilüsyon oranına göre belirtilen semen ve dilüent, pozitif replasmanlı pipet ile uygun hacimde aspire edildi.

• Yapılan her pipetaj işlemi sırasında aspire edilen bütün sıvı hacim aktarıldı ve pipetin hacmi etkileyecek ucu hariç, dış kısmı bu aktarım sırasında hep silindi.

• Hemositometrenin özel lameli hafif buhar yardımı ile sayım kamarasının üzerine yerleştirildi ve yerinden oynamadığı teyit edildi.

• Seyreltilmiş semen karışımı en az 15 sn boyunca vortekslendi.

• Pipet yardımı ile 2-3 kez daha aspire edilen seyreltilmiş semen örneğinden 10 µl alınarak hemositometrenin sayım alanına aktarıldı.

• Hemositometre aşırı ya da daha az miktarda doldurulmaktan kaçınıldı.

• Seyreltilmiş numune tekrar karıştırılarak yine 10 µl aspire edildi ve hemositometrenin diğer alanıda dolduruldu.

• Hazırlanan hemositometre, içeriğindeki spermin kamarada çökmesi ve bu süre içinde buharlaşmasının önlenmesi için 15 dk boyunca hazırlanmış nem odasında bekletildi.

• Sayım için faz kontrast mikroskobunun 20X’lik objektifi kullanıldı.

• 9 tane büyük sayım alanında 5 numaralı ve ortada yer alan 25 küçük kareli sayma alanı belirlendi.

• Bu sayım alanındaki küçük karelerin her biri 3’lü çizgilerle çevrelenmiştir. Kare sınırı bu üç çizgiden ortada yer alanıdır. Buna göre, sperm başının büyük bölümü iki iç sınır çizgisi arasında ise sperm hücresi sayıldı, iki dış sınır çizgisi arasında ise o kareye ait spermler arasında sayılmadı. Ayrıca komşu karelerde aynı sperm hücresini saymaktan kaçınmak için, iki komşu kareyi ayıran çizgide kalan sperm hücrelerinin başı, karenin sol ve alt orta sınırında kalanlar sayıma alındı, karenin sağ ve üst çizgisinde olanlar ise sayıma alınmadı.

• Baş ve kuyruk bütünlüğü olan spermler sayım için kullanıldı.

• Her numuneden alınan iki eş örnekte en azından 200’er sperm hücresi sayıldı. • Bu sayıya ulaşmak için 5 numaralı büyük kareyi oluşturan 25 küçük kareden sol üstteki karede bulunan sperm sayısı burada kaç alan sayılacağını belirlemektedir. Sayım alanı Tablo 3.2’ye göre belirlendi.

Tablo 3.2. 5 numaralı sayım alanına göre sayılacak alanların belirlenmesi. 25 karenin sol üst köşesinde yer

alan karedeki sperm sayısı Sayılacak Kare Sayısı <10 Alandaki 25 karenin tamamını say

10-40 Alandaki 10 kareyi say

>40 Alandaki 5 kareyi say

• Sperm sayısının düşük olmasından dolayı alandaki 25 kare sayıldığında 200 adet hücreye ulaşılamadıysa sayı 200 olana kadar diğer sayım alanlarında devam edildi. Gerektiğinde bütün alanlar sayıldı.

• Aynı numuneden alınan iki örnekteki sayımlar karşılaştırıldı. Sonuçlar kabul edilir ölçüde ise hesaplamaya devam edildi. Uygun olmadığı durumda tekrar dilüsyon hazırlanarak sayım işlemi tekrar yapıldı. İki sayım sonucunun kabul edilebilir ölçüsü, Tablo 3.3’te belirtilmiştir. Burada iki sayım sonucunun toplamı ve farkı hesaplandı. Eğer fark tabloda verilen değerden daha düşükse sayım kabul edildi.

Tablo 3.3. Belirli bir toplam için iki sayım arasındaki kabul edilebilir farklar (WHO, 2010). İki Sayım Sonucunun Toplamı Kabul Edilebilir Fark İki Sayım Sonucunun Toplamı Kabul Edilebilir Fark İki Sayım Sonucunun Toplamı Kabul Edilebilir Fark 35-40 12 144-156 24 329-346 36 41-47 13 157-169 25 347-366 37 48-54 14 170-182 26 367-385 38 55-62 15 183-196 27 386-406 39 63-70 16 197-211 28 407-426 40 71-79 17 212-226 29 427-448 41 80-89 18 227-242 30 449-470 42 90-98 19 243-258 31 471-492 43 99-109 20 259-274 32 493-515 44 110-120 21 275-292 33 516-538 45 121-131 22 293-309 34 539-562 46 132-143 23 310-328 35 563-587 47

• Sayım sonuçları uyumlu olan örneklerde, sperm konsantrasyonu belirlemek için iki farklı sayımdan elde edilen toplam sperm sayısı Tablo 3.4’te belirtilen dilüsyon faktörlerine bölündü. Dilüsyon faktörü, 5 numaralı alanda sayılan küçük kare sayısı ve dilüsyon oranına göre belirlendi.

Tablo 3.4. 5 numaralı sayım alanı için dilüsyon faktörleri.

Dilüsyon Oranı 25 Kare 10 Kare 5 Kare

1:2 100 40 20

1:5 40 16 8

1:10 20 8 4

1:20 10 4 2

1:50 4 1,6 0,8

• Eğer 200 sperme ulaşmak için birden fazla alan sayıldı ise Tablo 3.5’te belirtilen dilüsyon faktörleri kullanıldı.

Tablo 3.5. Birden çok sayılan alan için dilüsyon faktörleri.

Dilüsyon Oranı 2 Alan 3 Alan 4 Alan 5 Alan 6 Alan 7 Alan 8 Alan 9 Alan 1:2 200 300 400 500 600 700 800 900 1:5 80 120 160 200 240 280 320 360 1:9 40 60 80 100 120 140 160 180

• Mililitredeki sperm konsantrasyonu, sayılan alan ve dilüsyon oranlarının belirlediği dilüsyon faktörlerine bölünen toplam sperm sayısı ile bulundu. • Mililitredeki yuvarlak hücre sayısıda bu şekilde hesaplandı.

• Sayım işlemi sonrasında hemositometre ve lamel, sperm ve sperm öldürücü özelliği olan dilüent maddesi kalıntılarını uzaklaştırmak için bir gece dezenfektan madde içinde bekletildi (ESHRE; 2002; WHO, 2010)