A análise do perfil SDS-PAGE foram focalizadas apenas nas frações albumina, globulina e glutelina. Entre os diferentes genótipos foi observado um padrão similar de distribuição das proteínas para os pesos moleculares em cada fração protéica.
Nas análises serão consideradas a presença e ausência de bandas (expressão diferenciada) como também bandas protéicas com maior (expressão induzida) ou menor
intensidade (expressão reprimida), respeitando as comparações entre as sementes mutantes e os genótipos selvagens.
A Figura 5 A e B ilustram o perfil protéico e a análise das bandas da fração globulina e albumina da semente. Esta fração mostrou um perfil de bandas protéicas que se distribuem entre 14kDa e 66kDa.
Nos mutantes de Oh43+ foi observado um perfil de bandas heterogêneo, além de um número maior de bandas protéicas quando comparados a Oh43+. O perfil SDSPAGE revelou duas proteínas de 6,50kDa e 23,90kDa com expressão induzida nos quatro mutantes. Também, o1 mostrou outras três proteínas de 25kDa, 46kDa e 50kDa, em o2 houve outras de 46kDa e 50kDa e em fl2 foram também observados duas de 25kDa e 50kDa. Os quatro mutantes apresentaram também expressão diferenciada de proteínas de 17kDa, 32kDa, 38kDa e 40kDa, ainda o1, fl1 e fl2 proteínas de 22kDa e 36kDa; e o1 e o2 uma proteína de 42kDa. Apenas em o2 foi registrado expressão reprimida de uma proteína de 22,50kDa.
Figura 5 A - Perfil SDS-PAGE (8-18%) da fração albumina e globulina de sementes de milho. 1) Oh43+; 2)
o1; 3) o2; 4) fl1; 5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5.
kDa Oh43+ o1 o2 fl1 fl2 W22+ o10 o11 o13 B37+ o7 B7977+ o5 66,00 + + + - + + - - - + + + - 50,00 + + + + + + + + + + + + + 47,00 - - - + 46,00 + + + + + + + + + + + + + 42,00 - + + - - + - - - + + + - 40,00 - + + + + + - - - + - 38,00 - + + + + + - - - + + + - 36,00 - + + - + - - - - + + - - 32,00 - + + + + + - - - + + + + 25,00 + + + + + - - - - 24,50 + + + + + + + + + + + + + 24,00 + + + + + + + + + + + + + 23,90 + + + + + + - - - - + - + 23,50 - - - + - + - - - 23,00 + + + + + + + + + + + + + 22,50 + + + + + + + + + + + + - 22,00 - + - + + - - - + + + + - 18,00 + + + + + + + + + + + + + 17,00 - + + + + - - + + - - - - 15,00 + + + + + + + + + + + + + 14,40 + - - - - + - - - + + - - 6,50 + + + + + + - + + + + + +
Figura 5 B - Análise SDS-PAGE* da fração albumina e globulina de sementes de milho. *Banda protéica exclusiva do mutante (verde); Banda protéica de maior intensidade (roxo); e Banda protéica de intensidade reduzida (amarela)
O perfil de proteínas revelou pouca variabilidade entre os mutantes e W22+, tanto na intensidade como também no número de bandas. Foi observado A expressão diferencial de duas proteínas de 17kDa e 23,50kDa em o11; e de 17kDa e 22kDa em o13. Outras duas proteínas de 50kDa e 46kDa tiveram expressão reprimida nos mutantes, como assim também três proteínas de 15kDa, 18kDa e 22,50kDa em o10, e uma de 22,50kDa em o11.
No caso de B37+ e o7 o perfil das bandas foi muito similar, observando-se no mutante apenas a expressão diferencial de uma proteína de 23,90kDa.
Quando comparados o5 e B7977+, foram observadas duas proteínas de 23,90kDa e 47kDa com expressão restrita ao mutante e outras quatro proteínas de 6,50kDa, 15kDa, 18kDa e 46kDa com expressão reprimida no mutante.
O gel SDS-PAGE da fração zeína será apresentado em duas classes separadas, sendo as classes zeína1 (Figuras 6) e a classe zeína2 (Figura 7). O perfil protéico da classe zeína1 revelou maior variabilidade na intensidade das bandas, entretanto a classe zeína2 apresentou menor variabilidade entre os diferentes genótipos. A distribuição das proteínas
na classe zeína1 foi entre 8kDa e 27kDa, entretanto na classe zeína2 foi entre 8kDa e 90kDa. Porém, as principais proteínas estiveram distribuídas entre 20kDa e 27kDa.
Figura 6 - Perfil SDS-PAGE da fração zeína1 de sementes de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1; 5) fl2;
6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. Coloração com nitrato
de prata. P-padrão molecular SIGMA (MW-SDS-70L)
Os polipeptídios da classe zeína1 com expressão reprimida estiveram distribuídos principalmente entre 19kDa e 27kDa, mas também num grupo de proteínas de baixa concentração entre 8kDa e 14kDa. Entretanto, na zeína2 as proteínas com expressão reprimida correspondem com bandas presentes em baixas concentrações, entre 10kDa e 15kDa, entanto que pouco efeito foi observado nas proteínas de maior concentração.
Deve-se destacar que o padrão de bandas entre 27kDa e 19kDa é característico da fração zeína. Na zeína1, a classe principal de bandas corresponde à classe α-zeína (19kDa e 22kDa) e um grupo pequeno de polipeptídios da classe δ-zeína (10kDa e 14kDa), entretanto na zeína2 a classe principal corresponde à γ-zeína (27kDa) e uma pequena classe β-zeína de 15kDa.
Figura 7 - Perfil SDS-PAGE da fração zeína2 de sementes de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1; 5) fl2;
6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P padrão molecular
Invitrogen. Coloração com nitrato de prata
Na fração glutelina foi constatado um perfil de bandas bem heterogêneo para presença, ausência e diferenças de intensidade das bandas. Foi registrado o maior número de bandas quando comparado com o perfil das outras frações protéicas. As proteínas da fração glutelina estiveram distribuídas entre 4kDa e 100kDa.
As Figuras 8 A e B ilustram o perfil e a análise das bandas protéicas dos mutantes e Oh43+. Foi observada uma proteína de 32kDa e 33kDa com expressão induzida nos mutantes, exceto o1, com ausência da proteína de 33kDa. Uma proteínas de 5,50kDa teve expressão restrita aos mutantes; especificamente nos mutantes o1, fl1 e fl2 uma proteína de 22,50kDa, em o1 uma proteína de 4kDa e em fl2 duas proteínas de 4kDa e 19kDa.
Ausência de proteínas também foi constatada para alguns mutantes, o maior número foi observado em o1 com cinco proteínas de 66kDa, 60kDa, 38kDa, 36kDa e 33kDa, entretanto apenas uma banda de 4kDa não foi observada em o2 e fl1.
O perfil e a análise das bandas protéicas dos mutantes e W22+ podem ser visualizados na Figura 8 A e B. Nos mutantes o11 e o13 foi observado expressão induzida
da proteína de 35,5kDa, em o11 de 35kDa e 6kDa, em o13 de 28kDa e 22kDa e em o10 duas proteínas de 22kDa e 6,50kDa. Houve expressão diferenciada de uma proteína de 47kDa em o13, de 26kDa em o13 e o10, de 12kDa em o11 e o10, e uma proteína de 4kDa em o11.
Figura 8 A - Perfil SDS-PAGE (8-18%) da fração glutelina de sementes de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) o2; 4) fl1;
5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P-padrão molecular
New England BioLab Coloração com nitrato de prata
Entretanto, ausência de bandas protéicas nos mutantes quando comparados com W22+ foram também observados, assim em o10 e o13 faltou uma proteína de 50kDa e outra de 10kDa; para o13 outras de 38kDa, 36kDa e 30kDa; para o10 e o11 uma proteína de 34,50kDa, para o13 e o11 uma de 29kDa, para o13 e o10 outra de 10kDa, para o13 uma com 6kDa e finalmente em o10 duas proteínas de 5,50kDa e 4,50kDa.
kDa Oh43+ o1 o2 fl1 fl2 W22+ o10 o11 o13 B37+ o7 B7977+ o5 66,00 + - + + + + + + + + + + - 60,00 + - - - - 56,00 + + + + + + + + + + + + - 55,00 + + + + + + + + + + + + - 50,00 - - - + - + - - + - - 47,00 + + + + + + + + + + + - - 45,00 + + + + + + + + + + + - - 44,00 - - - + - - 40,00 + + + + + + + + + - + - - 38,00 + - + + + + + + - + + + - 36,00 + - + + + + + + - + + + - 35,50 + + + + + + + + + + + + + 35,00 + + + + + + + + + + + + + 34,50 - - - + - - + + + - + 33,00 + - + + + + + + + + + + - 32,00 + + + + + + + + + + + + - 30,00 + + + + + + + + - - - - - 29,00 - - - + + - - - - 28,00 - - - + + + - - 27,50 + + + + + + + + + + + + - 27,00 + + + + + + + + + - - + - 26,00 + + + + + - + - + + + - - 25,00 + + + + + + + + + + + + + 22,50 - - + + + - - - - 22,00 + + + + + + + + + - - - - 20,00 + + + + + + + + + + + - - 19,00 - - - - + - - - - + + - - 16,50 + + + + + + + + + + - + + 14,00 + + + + + + + + - + + + + 12,00 + + + + + - + + - - - - - 10,00 + + + + + + - + - + + - - 8,00 + + + + + + + + + + + + + 6,50 + + + + + + + + + + + + + 6,00 + + + + + + + + - + + + + 5,50 - + + + + + - + + - - - - 5,00 + + + + + + + + + + + + + 4,50 + + + + + + - + + - + + + 4,00 - + - - + - - + - + - - +
Figura 8 B - Análise SDS-PAGE* da fração glutelina de sementes de milho. *Banda protéica exclusiva do mutante (verde); Banda protéica de maior intensidade (roxo); Banda protéica de intensidade reduzida (amarela)
O perfil e a análise das bandas protéicas de o7 e B37+ podem ser visualizados na Figura 8 A e B. O mutante o7 apresentou proteínas de 47kDa e 6,50kDa com expressão induzida. Outras quatro proteínas de 47kDa, 44kDa, 40kDa, e 4,50kDa, foram observadas unicamente nas sementes o7. Enquanto que no mutante o5 (Figura 8 A e B) unicamente duas proteínas de 34,50kDa e 4kDa foram observadas como expressas diferencialmente no
mutante. A ausência de nove proteínas também foi constatado, sendo de 66kDa, 56kDa, 55kDa, 38kDa, 36kDa, 33kDa, 32kDa, 27,50kDa e 27kDa.