Após determina as quantidades de proteínas de reserva do endosperma foi avaliado o perfil das proteínas em SDS-PAGE.
Foram observadas diferenças no perfil das proteínas entre os genótipos mutantes e os controles respectivos para ausência, presencia e intensidade de bandas, entretanto, isto foi mais acentuado no perfil das frações globulina e albumina.
No perfil da fração globulina foi detectada diferenças para o número e para a intensidade das bandas, observando-se numerosas bandas de baixa intensidade nos mutantes. As bandas protéicas estiveram distribuídas entre 9kDa e 100kDa.
Como ilustrado na Figura 9 A e B houve variação no perfil protéico entre Oh43+ e mutantes quanto à presença, ausência e intensidade das bandas. Expressão induzida com foram observadas para uma proteína de 35kDa em fl1 e outra de 46kDa em fl2. Proteínas de 38kDa e 32kDa foram expressas unicamente em o2, fl1 e fl2; outra proteína de 33kDa em fl1 e fl2 e outra de 11kDa em fl1. Houve duas proteínas com expressão reprimida, 35kDa em o1 e 13kDa em fl2. Finalmente, foi observada a ausência de uma proteína de 35kDa em o2 e fl2, mas que esteve presente nos restantes genótipos do grupo.
O perfil protéico dos mutantes de W22+ mostrou também diferenças quanto à presença, ausência e intensidade das bandas (Figura 9 A e B). Expressão induzida foi observada para uma proteína de 35kDa nos quatro mutantes; outras de 15kDa e 13kDa foram observadas em o13 e o10, respectivamente. A presença de proteínas com expressão restrita aos mutantes revelou uma proteína de 26kDa em o10, o11 e o13, outra de 68kDa e 65kDa em o11 e o13, e outra de 38kDa e 11kDa em o13 e o11, respectivamente. Bandas com expressão reprimida foram também observadas em o10 (100kDa, 90kDa, 75kDa, 72kDa e 46kDa) e o11 (27kDa, 19kDa e 9kDa). Por último, foi constatado a ausência de proteínas nos mutantes, principalmente em o10 foram sete (80kDa, 70kDa, 50kDa, 40kDa, 36kDa, 34kDa e 9kDa), em o11 foram quatro (36kDa, 25,50kDa, 24,50kDa e 15kDa) e em o13 foram apenas duas proteínas (25,50kDa e 24,50kDa).
No perfil protéico de o7 e B37+ foram observadas poucas variações quando comparados (Figura 9 A e B). Foi constatada uma proteína de 25,50kDa restrita a o7. Outras duas proteínas de 72kDa e 19kDa apresentaram expressão reprimida no mutante.
O perfil protéico entre B7977+ e o5 é ilustrado na Figura 9 A e B. O mutante o5 apresentou três proteínas de 46kDa, 35kDa e 9kDa com expressão reprimida.
Outras cinco proteínas de 70kDa, 50kDa, 34kDa, 33kDa e 15kDa estiveram presentes unicamente no endosperma mutante.
Figura 9 A - Perfil SDS-PAGE da fração globulina de endosperma de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1; 5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P padrão
molecular Invitrogen. Coloração com nitrato de prata
Na fração albumina foi observada um número maior de proteínas com expressão restrita aos genótipos mutantes (Figura 10 A e B). As bandas protéicas na fração albumina mostraram distribuição entre 8kDa e 91kDa
O perfil protéico dos mutantes o1, o2, fl1 e fl2 mostraram varias proteínas com expressão restrita aos mutantes. Expressão induzida de uma proteína de 20kDa foi observada nos quatro mutantes, entretanto em o2 e fl2 outra proteína de 23kDa.
Numerosas proteínas foram expressas de modo diferencial, três proteínas de 66kDa, 44kDa e 14kDa nos quatro mutantes; em o2, fl1 e fl2 uma proteína de 36kDa; em o2 e fl2 outra de 35kDa; e em o2 duas proteínas com 38kDa e 37,50kDa. Apenas duas proteínas de 37kDa e 13kDa foram reprimidas em o1 e fl2, respectivamente. Também foi verificado em o2 e fl2 ausência de uma proteína de 37kDa.
kDa Oh43+ o1 o2 fl1 fl2 W22+ o10 o11 o13 B37+ o7 B77/79+ o5 100,00 + + + + + + + + + + + + + 90,00 + + + + + + + + + + + + + 80,00 + + + + + + - + + + + + + 75,00 + + + + + + + + + + + + + 72,00 + + + + + + + + + + + + + 70,00 + + + + + + - + + + - - + 68,00 - - - + + - - - - 65,00 - - - + + + - + + 60,00 + + + + + + + + + + + + + 50,00 + + + + + + - + + + + - + 49,00 - - - + - - - - 46,00 + + + + + + + + + + + + + 40,00 + + + + + + - + + - - + + 38,00 - - + + + - - - + + + + + 37,00 - - - + - - - - 36,00 - - - + - - + + + - - 35,00 + + - + - + + + + + + + + 34,50 + + + + + + + + + + + + + 34,00 + + + + + + - + + + + - + 33,00 - - - + + + + + + + - - + 32,00 - - + + + + + + + - - + - 30,00 + + + + + + + + + + + + + 27,00 + + + + + + + + + + + + + 26,00 + + + + + - + + + + + + + 25,50 - - - + + - - - + - - 24,50 - - - + + - - - - 24,00 + + + + + + + + + + + + + 19,00 + + + + + + + + + + + - - 15,00 + + + + + + + - + - - - + 13,00 + + + + + + + + + + + + + 11,00 - - - - + - - + - - - - - 10,00 + + + + + + + + + + - + + 9,00 + + + + + + - + + + + + +
Figura 9 B - Análise SDS-PAGE* da fração globulina de endosperma de milho. *Banda exclusiva do mutante (verde); Banda de maior intensidade (roxo); e Banda com intensidade reduzida (amarela)
Nos mutantes o10, o11 e o13 destacaram-se principalmente bandas protéicas com expressão restrita ao endosperma dos mutantes (Figura 10 A e B). Houve expressão induzida de duas proteínas de 23kDa e 17kDa em o11. Numerosas proteínas foram expressas diferencialmente, três proteínas de 66kDa, 26,50kDa e 16,50kDa nos quatro mutantes; em o10 e o11 uma proteína de 40kDa; outras de 37,50kDa, 23kDa e 8kDa em o11 e o13. Apenas o10 registrou uma proteína de 20kDa com expressão reprimida.
Finalmente, foi observado ausência de proteínas de 67kDa, 38kDa, 26kDa, 25kDa, 24,50kDa, 22kDa, 17kDa e 9kDa em o10 e de 39kDa, 26kDa, 25kDa, 22kDa, 17kDa e 14kDa em o13, embora às mesmas proteínas estivessem presentes nos restantes genótipos deste grupo.
Figura 10 A - Perfil SDS-PAGE da fração albumina de endosperma de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1; 5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P padrão
molecular Invitrogen. Coloração com nitrato de prata
A comparação entre o perfil protéico de B37+ e o7 revelou apenas a presença de três proteínas de 41kDa, 25kDa e 17kDa expressas diferencialmente no endosperma mutante (Figura 10 A e B).
Em B7977+ e o5 o perfil SDS-PAGE mostrou poucas diferenças para presença, ausência e intensidade das bandas. (Figura 10 A e B). Foi observada expressão induzida para uma proteína de 37kDa. Alem de cinco proteínas de 67kDa, 66kDa, 44kDa, 41kDa e 16,50kDa expressas apenas no mutante.
kDa Oh43+ o1 o2 fl1 fl2 W22+ o10 o11 o13 B37+ o7 B77/79+ o5 91,00 + + + + + + + + + + + + + 75,00 + + + + + + + + + + + + + 67,00 + + + + + + - + + - - - + 66,00 - + + + + - + + + - - - + 55,00 + + + + + + + + + + + + + 44,00 - + + + + + + + + + + - + 41,00 + + + + + + + + + - + - + 40,00 - - - + + - - - + - 39,00 + + + + + + + + + + + + + 38,00 - - + - - + - + - + + + + 37,50 - - + - - - - + + + + - - 37,00 + + - + - + + + + + + + + 36,00 - - + + + + + + + + + + + 35,00 - - + - + - - - - 27,00 + + + + + + + + + + + + + 26,50 + + + + + - + + + - - + + 26,00 - - - + - + - - - + + 25,00 + - - - - + - + - - + - - 24,50 + - - - - + - + + + + + + 23,00 + + + + + - - + - + + + + 22,00 - - - + - + - + + + + 20,00 + + + + + + + - + + + + - 17,00 + + + + + + - + - - + - - 16,50 - - - + + + + + - + 15,00 + + + + + + + + + + + + + 14,00 - + + + + + + + - + + + + 13,00 + + + + + + + + + + + + + 10,00 + + + + + + + + + + + + + 9,00 + + + + + + - + + + + + + 8,00 - - - + - - + -
Figura 10 B - Análise SDS-PAGE* da fração albumina de endosperma de milho. *Banda exclusiva do mutante (verde); Banda de maior intensidade (roxo); Banda com intensidade reduzida (amarela)
O perfil protéico da zeína foi dividido em zeína1 (Figuras 11) e zeína2 (Figura 12). As proteínas na fração zeína1 estiveram distribuídas entre 9kDa e 70kDa. Foram observadas quatro bandas protéicas principais entre 22kDa e 27kDa, e outras bandas protéicas menores de baixa concentração entre 10kDa e 16kDa.
Nos mutantes de Oh43+, foi observada expressão reprimida de duas proteínas, entre 20kDa e 22kDa. No endosperma fl2 foram reprimidas claramente cinco proteínas entre 20kDa e 27kDa. Também nos mutantes de W22+ foram registradas proteínas com expressão reprimida, principalmente em o11 e o13 entre 22kDa e 27kDa. Nos mutantes o7
e o5 apesar de repressão da proteína 22kDa, o perfil foi muito similar a B37+ e B7977+, respectivamente.
As proteínas na fração zeína2 estiveram distribuídas entre 10kDa e 100kDa (Figura 12 A). O perfil zeína2 apresentou as principais bandas distribuídas entre 23kDa-27kDa, sendo que quando documentados géis com 500ng de proteína (Figura 12 B) foi possível observar duas bandas nítidas com 26kDa e 27kDa, ausentes aparentemente em o2 e o5. O perfil da zeína2 resulta mais heterogêneo para um conjunto de bandas protéicas de baixa concentração distribuídas entre 30kDa e 100kDa. Contudo, o perfil zeína2 não mostrou diferenças muito contrastantes entre mutantes e genótipos controles. Assim, as principais proteínas da classe zeína1, foram majoritariamente afetadas pelos genes mutantes do que as proteínas da classe zeína2.
Figura 11 - Perfil SDS-PAGE da fração zeína1 de endosperma de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1; 5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P padrão molecular
A Figura 13 A e B ilustram o perfil protéico da fração glutelina e as análises quanto à presença, ausência e intensidade das bandas. As bandas protéicas estiveram distribuídas entre 8kDa e 100kDa.
Os mutantes o2 e fl1 tiveram duas proteínas de 15kDa e 12kDa com expressão induzida. Foram também constatados a presença de proteínas com expressão restrita ao endosperma de fl1 e fl2 (21kDa) e o2 e fl1 (8kDa). Expressão reprimida de algumas proteínas foi constatada nos mutantes, sendo três proteínas de 25kDa, 24kDa e 23kDa em o2 e fl2, uma proteína de 22kDa em o2 e duas proteínas de 17kDa e 16kDa em o1. Apenas uma proteína de 23kDa esteve ausente em o1 e fl1, mas presente em Oh43+, o2 e fl2.
Figura 12 A - Perfil SDS-PAGE da fração zeína2 de endosperma de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1;
5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P padrão
Figura 12 B - Perfil SDS-PAGE da fração zeína2 de endosperma de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1;
5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P padrão
molecular Invitrogen. Coloração com nitrato de prata. Quantidade de proteína: 500ng
Figura 13 A - Perfil SDS-PAGE da fração glutelina de endosperma de milho. 1) Oh43+; 2) o1; 3) (o2); 4) fl1; 5) fl2; 6) W22+; 7) o10; 8) o11; 9) o13; 10) B37+; 11) o7; 12) B7977+; 13) o5. P padrão
kDa Oh43+ o1 o2 fl1 fl2 W22+ o10 o11 o13 B37+ o7 B77/79+ o5 100,00 + + + + + + + + + + + + + 99,00 + + + + + + + + + + + + + 90,00 + + + + + + + + + + + + + 85,00 + + + + + + + + + + + + - 75,00 + + + + + + + + + + + + + 65,00 + + + + + + + + + + + + + 58,00 + + + + + + + + + + + + + 55,00 + + + + + + + + + + + + + 50,00 + + + + + + + + + + + + + 49,00 + + + + + + + + + + + + + 45,00 + + + + + + + + + + + + + 37,00 + + + + + + + + + + + + + 35,00 + + + + + + + + + + + + + 31,00 + + + + + + + + + + + + + 29,00 + + + + + + + + + + + + + 27,00 + + + + - + - + - + + + + 26,00 + + + + + + - + - + + + + 25,00 + + + + + + + + + + + + + 24,00 + + + + + + + + + + - + + 23,00 + - + - + + + + - - + - - 22,00 + + + + + + + + + + + + + 21,00 - - - + + - - + - + + + - 18,00 - - - + - - - + + - - 17,00 + + + + + + + + + + + + - 16,50 - - - + - - - + - - 16,00 + + + + + + - + + + + - + 15,00 + + + + + + + + + + + + + 13,00 - - - + - - - - 12,00 + + + + + + - + + + + + + 9,00 + + + + - + + + + + + + + 8,00 - - + + - + - + + + + + -
Figura 13 B - Análise SDS-PAGE* fração glutelina de endosperma de milho. *Banda exclusiva do mutante (verde); Banda de maior intensidade (roxo); Banda com intensidade reduzida (amarela)
O perfil SDS-PAGE de W22+ e mutantes mostrou diferencias para presença, ausência e intensidade de bandas (Figura 13 A e B). Unicamente no mutante o11 foram observadas duas proteínas de 27kDa e 26kDa com expressão induzida. No mutante o11 houve repressão de uma proteína de 21kDa e em o10 duas proteínas de 16,50kDa e 13kDa. Foi observado ausências de duas proteínas de 27kDa e 26kDa em o10 e o13, de 23kDa em o13, de 16kDa, 12kDa e 8kDa em o10.
O perfil SDS-PAGE de B37+ e o7 apresentaram diferenças para presença, ausência e intensidade de bandas (Figura 13 A e B). O mutante o7 apresentou duas proteínas de 23kDa e 16,50kDa com expressão diferencial e quatro proteínas de 27kDa, 26kDa, 22kDa e 21kDa com expressão reprimida.
No perfil SDS-PAGE de B7977+ e o5 foram constatados que uma proteína de 75kDa foi induzida em o5 e a expressão diferenciada de uma proteína de 16kDa, alem da expressão reprimida de quatro proteínas de 100kDa, 99kDa, 90kDa e 12kDa.