Fungal inokülasyon

Daldırma işlemleri neticesinde elde edilen 24 farklı kuru meyve partisinin her biri 100

g’lık 3 parçaya bölünmüştür. Bu kısımlardan ilkine Aspergillus parasiticus DSM 5771 küf suşu, ikincisine Zygosaccharomyces rouxii ATCC 28253 maya suşu inoküle edilmiştir. Ayrılan 3. kısıma ise herhangi bir inokülayon yapılmamış ve kontrol grubu olarak belirlenmiştir.

3.2.1.4.1. Püskürtücü özelliklerinin belirlenmesi

İnokülasyon işlemi polipropilen püskürtücü şişeler kullanılarak yapılmıştır. Püskürtme şişelerinin; bir defada boşalttığı sıvı hacmi ve püskürtme alanı büyüklüğü gibi fiziksel özelliklerini belirlemek için püskürtme şişesi içine su koyularak ön denemeler yapılmıştır.

Püskürtücünün tetiğine bir kez basıldığında püskürttüğü sıvının miktarını belirlemek için öncelikle püskürtücünün ağzı ölçekli bir deney tüpüne sokularak püskürtme tetiğine 5 kez basılmıştır. Deney tüpünde toplanan sıvının hacmi 5’e bölünerek bir defadaki püskürtme hacmi hesaplanmıştır. Bu işlem 5 kez tekrar edilerek ortalama değer alınmıştır. Aynı zamanda püskürtme hacmi hesaplama işleminin doğruluğunu kontrol etmek için yine püskürtücü şişenin püskürtme ağzı 5 mL’lik bir cam pipetin üstteki boşluğuna dışarı sıvı çıkmasına imkan vermeyecek şekilde dikkatlice yapıştırılarak tetiğe bir kez basılmak suretiyle pipetin içine dolan sıvı miktarına bakılmıştır. Her iki yöntem uygulanarak yapılan işlemler sonucunda püskürtücü şişenin tetiğine her tam basışta 0,9 mL sıvı boşalttığı tespit edilmiştir. Püskürtme hacmini tespit etmek için uygulanan yöntemler Şekil 3.12.’de şematize edilmiştir.

48

Püskürtücünün etki ettiği püskürtme alanını belirlemek için; Şekil 3.13.’te görüldüğü

gibi püskürtücü yere paralel tutularak düz bir filtre kâğıdına püskürtme işlemi yapılmış ve püskürtme alnındaki ıslaklığın çapı (R) ölçülmüştür. Yapılan ön denemeler sonucunda 15 cm’lik R değerine ulaşmak için püskürtme işleminin 14 cm mesafeden (L) yapılması gerektiği tespit edilmiştir. Ön denemeler 5 defa tekrar edilerek ortalama değerler alınmıştır.

3.2.1.4.2. Püskürtücülerin sterilizasyonu

Püskürtme şişelerini steril edebilmek için öncelikle şişelerin içerisine ≈150 mL %70’lik (v/v) ethanol çözeltisi, dezenfektan olarak konulmuş ve şişeler 10 dk boyunca iyice çalkalanmıştır. Şişelerin içindeki dezenfektan sıvının ≈100 mL’si döküldükten sonra kalan kısım da şişenin püskürtme kafası monte edilip, püskürtme tetiğine tekrar tekrar basmak

R: Sprey etki alanı çapı L: Uygulama uzaklığı.

R L

49

suretiyle püskürtülerek şişe boşaltılmıştır. Böylece şişenin hem iç yüzeyleri hem de püskürtme kanalları iyice dezenfektan ile muamele ettirilmiştir. Sonrasında şişelerin içerisine ≈150 mL steril serum fizyolojik koyulup, dezenfektan ilave edilerek yapılan uygulamadaki gibi, önce çalkalanarak daha sonra da püskürtülerek şişe içeriği boşaltılmış böylece şişenin iç yüzeylerinde ve püskürtme kanallarında dezenfektan kalıntısı kalmaması sağlanmıştır.

3.2.1.4.3. Küf ve maya süspansiyonlarının hazırlanması

Araştırmada kullanılan küf (Aspergillus parasiticus DSM 5771) ve maya (Zygosaccharomyces rouxii ATCC 28253) suşları çalışma süresince ayda bir yatık PDA (Potato Dextrose agar – Merck, Almanya) besiyerinde yenilenerek +4˚C’de muhafaza edilmiştir. Püskürtme şişesi içerisine konulacak olan küf – maya süspansiyonu için taze olarak yatık PDA besiyerine ekimi yapılan kültürler 25˚C’de 7 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon bitiminde yatık agarda gelişen kültürlerin üzerine 10 mL %0,01(v/v)’lik Tween 80 (Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monooleate, Merck, Almanya) ihtiva eden steril serum fizyolojik ilave edilerek 1 dk boyunca tüp karıştırıcıda karıştırılmıştır. Karıştırma işlemi de bittikten sonra içerilerinde 240 mL steril serum fizyolojik bulunan iki adet püskürtme şişesinin içerisine maya hücresi süspansiyonu ve küf misel-spor süspansiyonu ayrı ayrı dökülerek inokülasyon süspansiyonları elde edilmiştir. İnokülasyon süspansiyonlarının yükü PDA ortamında yüzeye ekim yapılarak tespit edilmiştir. Buna göre Küf süspansiyonunun yükü 7x104 kob/mL maya, maya süspansiyonunun yükü de 4x104 kob/mL olarak bulunmuştur.

3.2.1.4.4. Püskürtme işlemi

Kuru meyvelerin üzerine yapılacak olan püskürtme işleminin homojen ve tekrarlanabilir olması için bir düzenek kurulmuştur. Bu düzenek 20x20cm büyüklüğünde bir paslanmaz çelik gözenekli tepsi, 15 cm çapında ve 15 cm yüksekliğinde galvaniz boru ve boruyu ortalayacak şekilde hazırlanmış çelik telden oluşmuştur. Paslanmaz çelik tepsi üzerine koyulan boru içerisine 50 g olarak ayrılmış kuru meyveler tek kat olacak ve mümkün olduğunca boşluk kalmayacak şekilde yerleştirilmiştir. Sonrasında, ortasındaki boşluk borunun tam merkezine denk gelecek şekilde hazırlanan tel de borunun üzerine yerleştirilip püskürtme şişesi yere paralel ve püskürtme ağzı telin ortasındaki boşluğa girecek şekilde tutularak bir tam püskürtme işlemi yapılmıştır. Silindir şeklindeki galvaniz boru hem püskürtme sırasında etrafa küf-maya süspansiyonunun saçılmasını engellemiş hem de her defasında aynı yükseklikten püskürtme

50

işleminin yapılmasını sağlamıştır. Püskürtücünün 15 cm çaplı bir alanda etkili olabilmesi için 14 cm yükseklikten püskürtme yapılması gerektiği daha önce belirtilmiştir. Bununla birlikte, püskürtücünün ağzı düzeneğin üzerindeki boşluktan 1 cm içeri girdiği için borunun yüksekliği 15 cm olarak belirlenmiştir. Küf ve maya püskürtme işlemleri ayrı düzeneklerde ve ayrı tezgahlarda yapılmıştır. Düzeneğin sterilizasyonu için hem meyvelerin dizildiği gözenekli tepsiler, hem boru hem de tel her püskürtme işlemi öncesi, öncelikle tüm yüzeylerine etanol püskürtülüp sonrasında bek alevi üzerinde tutularak sterilize edilmiştir. Kuru meyveler düzenek soğuduktan sonra yerleştirilmiştir. Püskürtme işlemi akım şeması Şekil 3.14.’te fotoğrafları ile birlikte verilmiştir. A: Galvaniz borunun ve Telin sterilizasyonu B: Kuru meyvelerin dizildiği gözenekli tepsinin sterilizasyonu C: Düzenek üstten görünüm D: Meyveler dizildikten sonra düzenek E: Küf, spor-misel süspansiyonunun hazırlanması F: Maya süspansiyonunun hazırlanması G: Püskürtme işlemi

Şekil 3.14. Püskürtme işlemi basamakları

A B C D G D E D F D

51