Fiziksel Metodlar

2.4.1.2. Adsorbsiyon

İmmobilizasyonda kullanılan en eski ve basit yöntemdir (Telefoncu 1999). Katı matriks üzerine enzim kolay ve hızlı bir şekilde fiziksel adsorbsiyon yöntemi kullanılarak immobilize edilmektedir. Bu metotda enzim ile matriks arasında van der Waals gibi zayıf bağlar ile hidrofobik, hidrofilik veya iyonik etkileşimlerle meydana gelmektedir. Enzimin aktif bölgesi bu bağlanmadan etkilenmez ve aktivitesini korur (Mulchandam ve ark 1998).

Birçok enzimin immobilizasyonu adsorbsiyon yöntemine göre gerçekleştirilmektedir. Çözünmeyen enzimler için adsorbsiyon yönteminin temel

avantajı kimyasal madde kullanmaya gerek olmaması ve hazırlanması basit bir kaç adımda gerçekleştirilebilmesidir. Sonuç olarak adsorbsiyon ucuz, kolay uygulanabilir ve enzimleri etkilemeyen metottur (Gorton 2005). Zayıf bağlar nedeniyle protein desorbsiyonu (pH, sıcaklık ve iyon yükünün değişmesinden kaynaklanan) problem olarak görülmektedir. Diğer bir dezavantajı ise spesifik bir adsorbsiyon olmadığından diğer protein yapıdaki biyolojik maddelerde yüzey de girişim yapabilmektedir (Guisan 2006; Zhang ve ark. 2008).

2.4.1.2 Dış Membrana Tutuklama

Bu metot elektrot yüzeyindeki membran içerisine enzimin hapsedilmesiyle gerçekleştirilir. Membran içerisinde kalan oluşan uygun boşluklardan substrat difüze olur ve reaksiyon gerçekleşir. Çok çeşitli sayıda membran bulunmaktadır. Örneğin naylon, selüloz nitrat, selüloz asetat, epoksi reçinesi, kollagen, polisülfonlar, poliakrilatlar ve polikarbonatlar. Bu metotun dezavantajları substratların, oluşan ürünlerin ve membranda bulunan inhibitörlerin hareketi ile ilişkilidir. Bu maddeler enzim tabakasının inhibisyonuyla hatalı ölçüm almasına sebep olabilir (Rusling 2003). Şekil 2.17’de ticari glukoz sensör şematize edilmiştir.

2.4.1.3. Tutuklama

Polimerleşme sırasında enzim diyaliz membranlarına ya da gözenekli jel matrikslerine tutuklanarak enzim immobilizyonu yapılır. Düşük molekül ağırlıklı substratlarla reaksiyon ürünlerinin difüze olması bazı yapılarda mümkündür. Poliakrilamid jeller, polivinil alkoller, yüklü polimerler, katyonik ve anyonik gruplar gibi çok sayıda materyal enzim tutuklama metodunda kullanılır (Rusling 2003).

Genellikle bu immobilizasyon metodu bütün enzim türleri (dehidrogenazlar, alkol oksidazlar, kolinesterazlar, kolin oksidazlar, glukoz oksidazlar ve tirozinazlar) için uygundur. Bununla birlikte diğer sistemlere göre kolay uygulanabilir ve ucuzdur. Bu metodun dezavantajları ise ortamda serbest radikaller bulunduğunda veya enzim immobilizasyonu sağlandıktan sonra polimerizasyonu tamamlamak için elektroda ultraviyole radyasyon uygulandığında enzim aktivitesini kaybedebilmektedir (Gorton 2005). Bu problemler biyosensörün cevap zamanını ve kararlılığını etkilemektedir. Son zamanlarda jel matriks temelli immobilizasyon metotları yaygın olarak biyosensör yapımında kullanılmaktadır. Çünkü jel materyalleri spesifik özeliklere sahip olmaları nedeniyle biyosensörlerin sağlamlık, ısıya dayanıklılık, çözücü ortamlarından etkilenmeme, organik ve sulu ortamlarda çalışabilme gibi özelikleri kazanmasını sağlamıştır (Guisan 2006; Zhang ve ark. 2008).

2.4.1.4. Elektropolimerizasyon

Enzimler, polipirol, polifenol, polianilin ve politiyofen gibi fiziksel olarak iletken polimerler kullanılarak immobilize edilebilmektedirler. Elektrokimyasal potansiyostatik ve galvanostatik yöntemler kullanılarak monomerlerin polimerizasyonu ile hassas ve ince tabaka şeklinde enzimler immobilizasyonu sağlanır. Bu tekniğin avantajları immobilizasyon işleminin kontrol edilebilmesi, birçok elektrot materyalinin kullanılabilir olması (platin, altın ve karbon) ve minyatürizasyona uygun olmasıdır. Hazırlama işleminin basit olmasına rağmen bu yöntemin dezavantajı immobilize olan enzim miktarının tam olarak belirlemenin zor olmasıdır (Rusling 2003). Şekil 2.18’de pirolün elektropolimerizasyonu gözlenmektedir.

N H Elektrot -e N H Nu: N H N_H N N H H H H N N H H H H -2H+ Elektrot -e -2H+ N N H H Elektrot -e N N H H vb. vb. N N N N H H H H

Şekil 2.18. Pirolün elektrokimyasal polimerizasyonu için genel mekanizma

2.4.1.5 Elektrot Modifikasyonu

Enzim imobilizasyonu ticari olarak bulunan aktif hale getirilmiş grafit ya da epoksi-grafit içeren materyaller üzerine enzim ilave edilerek yapılabilir. Bu işlem

elektrodun yüzeyinde duyarlı bir tabaka elde etmek için yapılır. Bu yöntemle yapılan elektrotlar kararlılığı çok iyi ve kullanım ömrü uzundur (Gorton 2005).

2.4.1.2. Kimyasal Metotlar

2.4.1.2.1 Kovalent Bağlama

Çok yaygın olarak kullanılan bu yöntemde enzim ile elektrot yüzeyinde bulunan matriks arasında kovalent bağ meydana gelir. Bu bağ enzim ve matriksde bulunan fonksiyonel gruplar arasında meydana gelir. Enzimin aktif bölgesinin kovalent bağ oluşumuna katılmaması gerekir bu nedenle kovalent bağlanma işlemi sırasında çözeltiye enzim inhibitörleri ilave edilir. Uygun koşullar altında proteinlerin fonksiyonel grupları kovalent bağlanabilmektedirler. Örneğin zincirin α-amino grupları, lizin ve arjinin ɛ- grupları, zincirin α-karboksil grupları, aspartik asit ve glutamik asitlerin β- ve γ- karboksil grupları, tirozinin fenol halkası, sisteinin tiyol grubu, serin ve treoninin hidroksil grupları, histidinin imidazol grubu ve tritofanın indol grubu. Enzimlerin kovalent bağlanmasında kullanılabilecek aktif gruplar Çizelge 2.8’de verilmiştir (Guisan 2006).

Çizelge 2.8. Enzimlerin kovalent bağlama ile immobilizasyonda bağ oluşumuna katılan amino asit grupları

A B C D E

F G H

A: N-Terminal amino asitlerin amino grubu ve lizinin α-amino grubu

B: C-Terminal amino asitlerin ve aspartik asit ve glutamik asidin serbest karboksil grupları

C: Sistein sülfhidril grubu D: Metiyoninin tiyoeter grubu E: Histidinin imidazol grubu F: Arginin guanidinil grubu G: Tirozinin fenolik grubu H: Triptofanın indolil grubu

Protein üzerinde bulunan amino grupları ve fenolik kısımlar hariç diğer fonksiyonel gruplar reaksiyonlarla ile bir araya gelebilmektedir (Zhang ve ark. 2008). Amino etil selüloz, karboimidli bir ortamda enzimdeki karboksil gruplarıyla bağ oluşturur. Proteindeki tiol kısımları yükseltgenerek N-akriol-sistein ve çapraz bağlayıcı akrilamid kopolimerleriyle bağ oluşturmaktadır. Birçok ticari aktive edilmiş membranlar kovalent olarak enzim immobilizasyonunda kullanılmaktadır (Mulchandam ve ark 1998). Şekil 2.19’da çok kullanılan kovalent bağlanmalara örnekler görülmektedir.

a. s-Triklortriazin ile açilleme

b. Karboimit metodu

c.Diazonyum tuzu ile kenetlenme

d. Tiyol grupları ile bağlanma

Şekil 2.19. Çok kullanılan kovalent bağlanma reaksiyonları

Bu enzim immobilizasyon metodunda immobilize olan enzim sayısı yüksek olmasına rağmen hazırlama işlemleri çok karmaşıktır.

2.4.1.2.2 Çapraz Bağlama

Bu yöntem de tutuklama ve kovalent bağlama metotlarının birlikte uygulanmasıyla biyosensör hazırlanır. Çapraz bağlamada sık olarak kullanılan kimyasallar; glutaraldehid, 1,5 difloro-2,4 dinitrobenzen, 2-izosiyanato-4- izotiyosiyanato-toluen, hekzametilen diizosiyanat ve disüksinil suberattır (Gorton 2005). Bazılarının formülleri şekil 2.20’de verilmiştir. (Telefoncu ve ark.1999)

2.4.1.2.2.1 Glutaraldehid İle Çapraz Bağlama H C O CH2CH2CH2C O H H C O CH2CH2C H C O H H H C O CH2CH2CH2C O H H C O CH2 CH2 CH CHO CH OH CH2 CH2 CH2 C O H H C O CH2 CH2 C CHO C H CH2 CH2 CH2 C O H H C O CH2 CH2 CH2 C O H n _{H C} O CH2 CH2 C CHO CH CH2 CH2 C CHO CH CH2 CH2 CH2 C O H n NH2 E1 _, E2 NH2 H C O CH2 CH2 CH CHO CH NH CH2 CH2 CH CHO CH NH CH2 CH2 CH2 C O H E1 E2 n -H₂O

2.4.1.2.2.2 Bifonksiyonel Reaktiflerle Çapraz Bağlama

a) Alkil ve arilkloroformatlar ile çapraz bağlama

c) Divinilsulfonlar ile çapraz bağlama

d) p-Benzokinon ile çapraz bağlama

e) Transizyon metal iyonları ile çapraz bağlama

2.4.1.2.3 Ağ Deseni

Glutaraldehid enzim moleküllerini ağ deseni şeklinde sararak onları çözünmez ve dayanıklı hale getirmektedir. İmmobilize olan enzimin kararlılığını artırmak için ağ deseni yöntemi inert proteinlerin bulunduğu ortamlarda yapılır. Bu immobilizasyon yönteminin avantajları enzim-enzim ve enzim-protein bağlanmasını oluşturmaktadır. Ağ deseni yöntemi difüzyona engel olabilecek yapılar oluşturabildiği gibi bu yöntemle hazırlanan biyosensörün cevap zamanı yüksek olabilmektedir (Guisan 2006).

2.4.1.2.4. Tek Tabaka İçerisine Enzim Yerleştirme

Bu metot son zamanlarda biosensör yapımında sık kullanılmaktadır. Bu metot kontrollü ve odaklamalı enzim immobilizasyonuna imkan sağlamaktadır. Böylece altın, platin ve gümüş gibi metalik elektrotların üzerine istenilen şekilde enzim immobilizasyonu yapılabilmektedir (Gorton 2005). Pratik olarak bazı moleküller (tiyoalkanlar, silanlar ve benzerleri gibi) elektrot yüzeyinin aktivasyonunda ve tek tabaka şeklinde elektrotun yüzeyinde yer alırlar (Rusling 2003). Enzim immobilizasyonu için spesifik moleküller kullanılarak hazırlanan bazı tek tabakalar kovalent bağlanma ya da spesifik bağ (enzim affinitesi ya da protein-ligand tanıma işlemi) oluşturabilmektedir. Bu yöntemle asit grupları, süksinimid ve karbonimid grupları ile amin grupları ise glutaraldehidle aktifleştirilir.