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O uso de coquetéis de vários agentes de miRNA', juntamente com agentes quimioterápicos ou agentes direcionados molecularmente, pode resultar em importantes efeitos sinérgicos, beneficiando pacientes.

A expressão ectópica de miR 30c, que é um bom marcador prognóstico para câncer de mama humano, foi capaz de sensibilizar as células cancerígenas à doxorrubicina em um modelo de xenotransplante de tumores

de mama humanos triplo-negativo em camundongos. Esta sensibilização foi alcançado pela regulação negativa da twinfilin 1 (TWF1) e IL11, dois genes codificadores de proteínas que regulam a sensibilidade a drogas (Bockhorn et al., 2013). Da mesma forma, a combinação de 5-fluorouracil com um vetor adenoviral que expressa o supressor de tumor miR-145 demonstrou exercer um efeito antiproliferativo mais potente, tanto in vitro quanto em modelos in vivo de câncer de mama, do que o tratamento com 5-fluorouracil sozinho (Kim et al., 2011).

1.9.7 Desafios e perspectivas

O desenvolvimento de estratégias de miRNA e lncRNA-alvo enfrenta diversos obstáculos. Um deles é o sucesso da entrega do agente terapêutico para os tecidos-alvo que pode ser influenciado negativamente, por exemplo, no momento da sua liberação a partir do sangue para o tecido-alvo, por meio do endotélio capilar, quando os complexos são maiores do que 5 nm de diâmetro (Whitehead et al., 2009).

Além disso, estas formulações de circulação sistêmica podem ser influenciadas negativamente pelo sistema imunológico do hospedeiro, pois os macrófagos e monócitos podem remover tais moléculas de espaços extracelulares (Broderick, Zamore, 2011).

A recente descoberta de que a eliminação do grupo oncogênico miR- 17/miR 92 provoca defeitos congênitos de desenvolvimento humano torna necessário que se considerem os efeitos, não relacionados ao câncer, de miRNAs na concepção de terapias (de Pontual et al., 2011).

O MRX34, desenvolvido pela Mirna Therapeutics, uma droga formulada em lipossomas do supressor de tumor miR 34, produziu regressão completa do tumor em dois modelos de linhagem de camundongos com câncer hepático, sem nenhuma atividade imunoestimulante observada ou toxicidade para os tecidos normais. Estes resultados originaram um ensaio clínico de Fase I (ClinicalTrials.gov; identificador: NCT01829971) (Ling et al., 2013).

2 OBJETIVOS

2.1 Primário

Avaliar a expressão de microRNAs, por PCR em tempo real, no carcinoma mamário ductal invasivo triplo negativo.

2.2 Secundários

Avaliar, por meio de imunoistoquímica, a expressão de KI-67, EFGR, CK 5-6;

Relacionar a expressão de miRNAs com a sobrevida livre de doença e a sobrevida câncer específica.

3 CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1 Casuística

Estudo descritivo de características histológicas, imunoistoquímicas e moleculares de tumores malignos de mama triplo negativos. Foram analisadas amostras teciduais provenientes de ressecção cirúrgica de carcinoma ductal invasivo de mama de pacientes tratadas e acompanhadas no Setor de Mastologia da Disciplina de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo a partir de 2002.

Foram avaliados material em parafina de tumor de 31 pacientes com as seguintes características: carcinoma invasivo de mama, receptores de estrogênio e de progesterona negativos e HER 2 negativo, bem como tecido mamário histologicamente normal.

Foram excluídos os casos em que não foi possível avaliar seguimento após cirurgia ou nas pacientes que receberam quimioterapia neoadjuvante.

3.2 Métodos

Os espécimes utilizados, fixados em formol e emblocados em parafina, foram dissecados para purificação do tecido tumoral sob orientação da patologista Dra. Ana Paula Torres e, posteriormente, Dr. Fernando Nalesso Aguiar, sob técnica padronizada. Nenhuma das etapas, exceto o estudo imunoistoquímico, foi realizada nas dependências do Hospital das Clínicas, apenas obtivemos os blocos parafinados de tumores das pacientes selecionadas. O processo de quantificação e análise da expressão de miRNA foi realizado no Laboratório de Ginecologia Estrutural e Molecular (LIM 58) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, sob orientação da bióloga Dra. Kátia Cândido Carvalho.

Para identificar sequências de miRNA nos tumores ductais invasivos triplo negativos, utilizou-se o Human Cancer miRNA PCR Array. Este define a expressão de 84 sequências de miRNA cujos níveis, em resultados publicados, relacionam-se bem com diagnóstico, estadiamento e prognóstico de vários cânceres ou tumores. Esse array permitiu aos pesquisadores analisar os mais relevantes miRNA relacionados à tumorigênese mamária. O material foi analisado em equipamento de PCR em Tempo Real modelo ABI 7500 Real Time PCR System, instrumento permanente do LIM-58 da Disciplina de Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O padrão de expressão de miRNAs foi avaliado.

O Human Breast Cancer miScript miRNA PCR Array permite definir o perfil de expressão de 84 miRNAs com expressão presumível ou conhecidamente alterada durante a iniciação ou progressão do câncer de mama. Esse array inclui miRNAs com funções conhecidas no câncer de mama, assim como miRNAs potencialmente envolvidos, tanto via estudos de microarray quanto a estudos por bioinformática de prováveis reguladores de genes relacionados a câncer de mama. Controles presentes no array permitem a análise usando método de quantificação relativa ΔΔCT, averiguação da qualidade da transcrição reversa e do PCR.

Para tanto, foram utilizados kits para extração de RNA de amostras fixadas e parafinadas – miRNeasy FFPE; kit miScript II RT para síntese de cDNA, kit miScript SYBR Green PCR e miScript miRNA PCR Arrays para análise de 84 sequências de miRNA de câncer humano. A placa contém 96 poços assim distribuídos: 84 primers de miRNA, dois controles de extração de miRNA, seis “housekeeping” snRNAs, dois controles de reação de transcrição reversa, dois controles positivos de PCR. Todos reagentes e placas são comercializados no Brasil exclusivamente pela Importação Indústria e Comércio Ambriex S.A.

Foram avaliados dados clínicos, como idade, paridade, amamentação, status menopausal; variáveis histológicas, como tamanho do tumor, status linfonodal, invasão linfática; características imunoistoquímicas, como expressão de Ki-67, EFGR e CK 5/6. O seguimento das pacientes buscou

verificar a ocorrência e o tempo de aparecimento de recidiva loco regional, metástase à distância e óbito.

Tais variáveis foram relacionadas à expressão dos miRNAs na tentativa de identificar ferramentas prognósticas moleculares.

Os custos da pesquisa, incluindo aqueles do laboratório, foram financiados por instituição fomentadora externa.

Seguem, abaixo, os protocolos utilizados nas etapas de obtenção dos cortes de tecido, desparafinização, extração de RNA, conversão em c-DNA e PCR em tempo real.