Erzurum İli Âşıkları

O cultivo de ) em alta densidade tem sido por muito tempo o método de escolha para a produção de proteínas recombinantes, e dessa forma a obtenção de altas concentrações celulares e o aumento na produtividade volumétrica constituem os principais objetivos de qualquer processo baseado no cultivo de linhagens recombinantes deste microrganismo (SHILOACH e FASS, 2005).

As estratégias de pesquisa para alcançar estes objetivos são basicamente a melhoria das técnicas de cultivo e a manipulação da fisiologia da bactéria. Acerca dos processos de cultivo, o uso de biorreatores operados em batelada alimentada tem sido empregado com sucesso por longa data para a formação de grandes quantidades de biomassa. Os principais obstáculos que precisam ser superados nesta estratégia de cultivo são a formação de subprodutos tóxicos, o acumulo de substrato e o suprimento de oxigênio.

Neste processo, a fase de alimentação é a etapa que requer maior atenção. Nesta fase o controle sobre a velocidade específica de crescimento torna se crítico uma vez que influencia a formação de metabólitos, a produtividade celular e a estabilidade do vetor recombinante. O crescimento exponencial de culturas de ) em alta densidade não deve exceder 50 g/L de massa seca (SHILOACH e BAUER, 1975), enquanto culturas cultivadas com baixas velocidades de crescimento podem atingir 190 g/L de massa seca, desde que obstáculos metabólicos estejam resolvidos (NAKANO , 1997). A velocidade de crescimento também está diretamente relacionada com a formação de subprodutos tóxicos do metabolismo. A formação de acetato, por exemplo, ocorre em meios complexos e definidos contendo glicose quando a velocidade específica de crescimento ultrapassa 0,2 ou 0,35 h1, respectivamente (PAALME 1990; MEYER , 1984). Além disso, a velocidade crítica de crescimento que leva à formação de acetato está relacionada à linhagem e ao meio de cultivo empregado.

Altas velocidades de transferência de oxigênio são requeridas para a obtenção de altas densidades celulares sem formação de ácidos orgânicos que inibam o crescimento celular e limitem a expressão de proteínas recombinantes (DE MEY , 2007). A manutenção de baixas velocidades de crescimento sob um regime de alimentação controlada é geralmente empregada para facilitar o controle sobre a oxigenação do meio e evitar a condição onde a capacidade oxidativa das

células é ultrapassada provocando conseqüente formação de produtos tóxicos que comprometem a condição ótima de operação (LEE, 1996).

A formação de acetato está entre os principais fatores que podem interferir na obtenção de altas densidades celulares. Em condições de aerobiose, a formação deste metabólito está associada ao crescimento em excesso de fonte de carbono. No caso do crescimento em excesso de glicose, por exemplo, o acúmulo de acetato está relacionado com a alta velocidade de crescimento, que provoca sobrecarga no ciclo TCA e gera a ativação das vias fermentativas. Em condições de falta de oxigênio estas vias também são ativadas e os ácidos orgânicos que inibem o crescimento passam a ser produzidos. Em geral, concentrações de acetato acima de 2,0 g/L diminuem a velocidade de crescimento da ) e podem prejudicar a biossíntese de proteínas recombinantes (SHILOACH e FASS, 2005). Entre os efeitos tóxicos provocados pelos ácidos orgânicos de cadeia curta, como o ácido acético, pode se citar a redução na velocidade de síntese de RNA, DNA, proteínas e lipídeos. Além disso, o aceto afeta várias proteínas e genes, particularmente aqueles envolvidos na maquinaria de transcrição tradução, e regulação e resposta ao estresse, e também interfere na biossíntese de metionina, provocando o acúmulo de homocisteína, que é um inibidor do crescimento celular (Eiteman e Altman, 2006).

A escolha do meio de cultivo naturalmente influencia a formação de biomassa e os demais parâmetros do processo, como formação de metabólitos e produção da proteína de interesse. As principais fontes de carbono em uso são a glicose e o glicerol, em meios com formulações definidas, semi definidas ou complexas. O Quadro 2.2 traz alguns exemplos de concentrações celulares máximas atingidas em diferentes meios e pelo uso de diferentes técnicas de cultivo.

Quadro 2.2 – Densidades celulares máximas atingidas em cultivos de ) por diferentes técnicas de cultivo

Técnica de propagação Meio básico Fonte de C Rendimento

gDCW/L

Referência

.

1. Crescimento exponencial

Meio semi definido com extrato de levedura

Glicose 54 Shiloac e Bauer,

1975 2. Crescimento linear

limitado pela fonte de C

Meio definido Glicose

sólida

134 Neidhardt ,

1974

Matsui .,

1989

Meio definido Glicose

Ácido cítrico

104 Riesenberg .,

1990

Meio definido Glicerol

Glicose 148 128 Korz , 1995 Hidrolisado protéico e extrato de levedura Glicerol 84 Macaloney ., 1996 3. Crescimento linear

lento para manter concentração de acetato próxima a zero

Meio definido Baixa glicose

Glicerol

145 Horn ., 1996

( 9

1. Reator com membrana de diálise

Contra o meio de crescimento completo

Glicerol 174 Märkl ., 1993

Contra meio basal Glicerol 190 Nakano ,

1997 2. Alimentação

“ < ”

Contra solução tampão de sais Glicerol alimentado separada/e 150 Ogbonna e Märkl, 1993 Fonte: Adaptado de SHILOACH e FASS, (2005).

Em cultivos de alta densidade de ) recombinante a produção da proteína de interesse está relacionada a diversos fatores, entre eles o momento da indução e a natureza do indutor utilizado para promover sua expressão. Ambos os fatores afetam também o crescimento celular, e diversos estudos tem sido desenvolvidos para avaliar o efeito de diferentes indutores (IPTG, lactose, choque térmico, etc) na formação de biomassa e produção de proteínas recombinantes (ZABRISKIE e ARCURI, 1996; SEEGER , 1995; GOMBERT e KILIKIAN, 1998). Para o caso de cultivos de alta densidade em frascos agitados, STUDIER (2005) propôs a formulação de meios de auto indução para proteínas recombinantes cuja expressão está sob o controle do . Nestes meios, a lactose, indutor

natural deste promotor, está presente na formulação desde o início, juntamente com outras fontes de carbono. Dessa forma, a expressão da proteína de interesse ocorre a partir do momento em que o microrganismo passa a consumir a lactose, sem que seja necessária a adição posterior de um indutor.

Diversas linhagens de ) são empregadas para a produção de proteínas recombinantes, e entre as mais utilizadas está a linhagem BL21(DE3). Esta linhagem é ideal para uso com sistemas de expressão baseados no promotor do bacteriófago T7, como os sistemas pET, pRSET e pCRT7, por exemplo. Em geral, as linhagens de ) B são mais empregadas que as linhagens derivadas da )

K12 por possuírem a via do glioxalato ativada e produzirem assim menos acetato (Eiteman e Altman, 2006).

are ideal for use with bacteriophage T7 promoter based expression systems ( , pRSET, pCR¤T7, and pET).