Birinci Dönem
ERMUKHAN BEKMAKHANOV’UN BİLİMSEL ARAŞTIRMALARININ TOTALİTER REJİM
A triagem microbiológica de produtos naturais é geralmente utilizada como teste preliminar para avaliar o seu potencial antimicrobiano e, de acordo com os resultados obtidos, pode-se elaborar uma seqüência de estudos mais detalhados na perspectiva de obtenção de maiores informações sobre sua atividade antifúngica. A informação obtida no método de difusão em meio sólido é apenas qualitativa e apresenta-se útil para estabelecer a sensibilidade do Penicillium spp. aos óleos essenciais utilizados no teste (HSIEH et al., 2001; LIMA, 2002).
No ensaio de triagem de atividade antifúngica dos OE sobre cepas de Penicillium foi observado que, os de E. globulus, L. nobilis, R. officinalis e S. albidum (28,5%) não produziram inibição sobre o crescimento das cepas de Penicillium (Tabela 3/ Figura 13). Por outro lado os OE de C. zeylanicum, C. limon, C. sativum, C. winterianus, C. citrates, L. angustifólia, O. majorana, O. vulgare, P. anisum e S. aromaticum (71,5%) apresentaram atividade antifúngica, inibindo o crescimento do fungo, cujos halos de inibição tiveram em média 20,63mm de diâmetro.
Na Tabela 3 podem ser observados os resultados obtidos para a triagem microbiológica dos 14 óleos essenciais, testados frente ao gênero Penicillium. Foi realizada a análise da ação antifúngica dos óleos essenciais frente as cepas do Penicillium, contaminante fúngico majoritário do ar ambiente, destacando-se os resultados encontrados para os OE de S. aromaticum, C. citrates, C. zeylanicum e O. vulgare pela expressividade dos halos de inibição, despontando estes como alternativa a ser utilizada no controle da qualidade do ar em ambientes.
Segundo Mistcher e colaboradores (1972), Alligianais e colaboradores (2001), Holetz e colaboradores (2002) e Houhgton e colaboradores (2007) os valores da CIM, variando de 50 a 500 µg/mL como atividade antimicrobiana ótima e de 500 a 1000 µg/mL indicam como um atividade moderada. Os resultados encontrados possibilitam afirmar por estes parâmetros a atividade dos oléos essenciais como ótima.
Tabela 3: Atividade antifúngica dos óleos essenciais frente às cepas de Penicillium spp. isoladas do ambiente da indústria de alimentos.
Óleo Essencial Amplitude dos Halos
de Inibição (mm) Média dos Halos de Inibição (mm) Cepas inibidas (%)
b 25 – 60 42,20 100,00 C. limon 6 – 25 13,30 78,57 C. sativum 8 – 30 15,10 92,85 C. winterianus 14 – 28 18,25 71,43 C. citratus 10 – 34 20,46 100,00 E. globulus 0,00 0,00 0,00 L. nobilis 0,00 0,00 0,00 L. angustifolia 10 – 30 21,70 64,28 O. majorana 6 – 36 12,80 92,85 O. vulgare 19 – 60 32,20 100,00 P. anisum 10-20 15,00 14,28 R. officinalis 0,00 0,00 0,00 S. albidum 0,00 0,00 0,00 S. aromaticum 9 – 24 15,30 100,00
Figura 13: Triagem microbiologica dos óleos essenciais de: R. officinalis (1); L. angustiolia (2); C.
zeylanicum (3); C. citratus (4); C. winterianus (5); C. sativum (6); S. aromaticum (7); P. anisum (8); E. globulus (9); C. limon (10); O. majorana (11); L. nobilis (12); O. vulgare (13); S. albidum (14) sobre as cepas de Penicillium AR5 (A), Penicillium AR2 (B), Penicillium AR10 (C), Penicillium AR9 (D).
Entre os resultados obtidos, ressalta-se a relevante atividade antifúngica exercida pelos óleos essenciais de C. zeylanicum, C. citratus, S. aromaticum, O. vulgare, que apresentaram efetividade de inibição frente a todas as cepas fúngicas ensaiadas. Caracterizado pela formação de halos de inibição do crescimento microbiano com diâmetro igual ou superior a 10 mm na totalidade de cepas testadas (100%), com uma média de halos de inibição de 27,54 mm de diâmetro.
Para Mahanta e colaboradores (2007), o OE de C.citratus em baixa concentração induz a germinação do Penicillium citrinum e em altas concentrações, resulta em sua completa inibição. Se correlacionado com os resultados, nesta pesquisa, onde o halo de inibição médio para o OE de C. citratus foi de 20,46mm, tendo atividade de inibição relatada em 100% das cepas testadas. Trabalho realizado por Gupta e colaboradores (2009) mostrou efeito antifúngico semelhante, do óleo essencial de S. aromaticum contra as cepas de Penicillium, do presente trabalho.
O OE de O. vulgare, inibiu o crescimento de 14 (100%) cepas de Penicillium spp., onde a média dos halos de inibição foi 32,20 mm de diâmetro. Portanto, os resultados registrados neste estudo encontram-se compatíveis com os dados registrados por Pereira e colaboradores (2006). Esses autores citam em seu trabalho, que o óleo essencial de O. vulgare inibiu o desenvolvimento dos fungos testados em todas as concentrações.
Os resultados registrados neste trabalho, mostraram que o OE de C. zeylanicum produziu um halo de inibição em média, 42,20 mm, mostrando significância em todas as cepas testadas com uma variação de halos no valor de 25 a 60 mm. Os dados publicados por Yage e colaboradores (2010) também atestaram que o óleo de C.zeylanicum é efetivo contra a Rhizopus nigricans, Aspergillus flavus e Penicillium expansum tendo por tanto um excelente potencial a ser explorado como agente antifúngico natural em alimentos.
Mediante o resultado expressivo do OE de C. zeylanicum o mesmo foi selecionado para dar prosseguimento aos experimentos de atividade antifúngica. Avaliou-se a concentração inibitória mínima, os efeitos causados pela exposição do óleo ao crescimento micelial do fungo e seus efeitos sobre a germinação dos esporos.
Os resultados da CIM obtidos neste estudo mostraram-se equivalente com o relatado por Trajano e colaboradores (2010), indicando a ação antibacteriana deste óleo frente a bacterias e fungos de interesse em alimentos. Para os demais experimentos foram utilizadas duas cepas com diferentes perfis de sensibilidade ao óleo essencial: PAR7 (CIM 256 µg/mL) e PAR12 (CIM 512 µg/mL).
Na avaliação da atividade antimicrobiana do OE de C. zeylanicum sobre as cepas de Penicillium foi observado que o produto nas concentrações de 256-512 µg/mL inibiu as 14 (100%) cepas do fungo, onde 7 (50%) foram inibidas com uma concentração de 256 µg/mL do OE e 7 (50%) detectou inibição com 512 µg/ml. Para o VEGA® o percentual de inibição nas concentrações foi de 3 (21,43%) com 256 µg/mL e 11 (78,57%) inibidas com 512 µg/mL. O óleo essencial de C. zeylanicum apresentou efeito inibitório sobre o crescimento das cepas de Penicillium spp. quando comparado ao VG (Tabela 4).
Tabela 4: Valores de CIM do óleo essencial (OE) de C. zeylanicum e VG sobre cepas de Penicillium spp.
Fungos
OE (µg/mL) VG (µg/mL) Controles
CIM CIM Tween 80
(10%) Controle de Microrganismos PAR1 512 512 + + PAR2 512 512 + + PAR3 256 512 + + PAR4 512 512 + + PAR5 512 512 + + PAR6 256 512 + + PAR7 256 512 + + PAR8 512 512 + + PAR9 512 512 + + PAR10 256 512 + + PAR11 256 256 + + PAR12 512 512 + + PAR13 256 256 + + PAR14 256 256 + +
O efeito do óleo essencial de C. zeylanicum nas concentrações de CIM/4 (64 µg/mL) CIM/2 (128 µg/mL), CIM (256 µg/mL), CIMx2 (512 µg/mL) sobre a cinética do crescimento micelial radial de PAR7 estão expostos na Gráfico 1A e 1B. Os resultados demonstram que o óleo essencial apresentou um efetivo poder de inibição da cinética de crescimento radial. A partir de 128 µg/mL, o óleo produziu resultados diferentemente (p<0,05) no último tempo de interação quando comparado ao controle. Enquanto que o VG somente na CIMx2 (1024 µg/mL) apresentou uma diferença (p<0,05) em relação ao controle no último tempo de interação.
Neste trabalho, ocorreu inibição do crescimento micelial com o uso do óleo essecial, semelhante ao encotrado por, Cvek e colaboradores (2010) que testaram o óleo essencial de C. zeylanicum frente às cepas de Peniccilium expasum isolado de maçã, tendo como resultado uma inibição de 100% do seu crescimento.
No Gráfico 2A e 2B estão representados os resultados da interferência do óleo essencial e do VG sobre a cinética de inibição do crescimento micelial radial da cepa PAR12. O óleo essencial também apresentou forte efeito inibitório com resultados diferentes significativamente (p<0,05) do controle a partir da CIM (512 µg/mL), em 12 dias. O VG apresentou diferença significativa apenas na CIMx2 (1024 µg/mL), em 12 dias. Estes resultados confirmam o perfil de maior resistência da cepa PAR12 em relação a PAR7 e, ainda, demonstram o maior efeito inibitório do óleo essencial de C. zeylanicum em relação ao sanizante VG.
A atividade do óleo essencial de C. zeylanicum foi comparada com a atividade do Vega- produto clorado – indicado pelas metodologias tradicionais – o uso de detergentes clorados na eliminação ou sanitização dos ambientes, entretanto, a eficiência do cloro como agente fungistático depende do pH do meio e da concentração de cloro livre (PRUSKY et al., 2001). Rubin (1983), em seu trabalho, destacou a atividade micobactericida do formaldeido, iodo, iodoforos e dos compostos clorados. O cloro, em suas várias formas, especialmente na de sais de hipoclorito, é um dos sanitizantes empregados com mais sucesso nas indústrias de alimentos. São compostos eficientes e de baixo custo, tendo larga aplicação (KIM, 2004).
Gráfico 1: Efeitos do óleo essencial (OE) de C. zeylanicum (A) e do produto Vega® (VG) (B) no crescimento micelial radial de
PAR7. a: p<0,05 quando comparado ao controle, em 12 dias de interação.
Os resultados encontrados para a cinética do crescimento radial das cepas PAR7 e PAR12 com a exposição ao óleo essencial, demonstraram um forte efeito de inibição. Para exposição ao produto clorado, revelou diferença apenas com a maior concentração e no maior tempo de exposição. No experimento realizado por Moreira (2007), o óleo de C. zeylanicum demonstrou um efeito fungicida sobre Aspergillus flavus, A. fumigatus, observado pela inibição total do crescimento micelial ao longo de 14 dias de exposição. Rosal e colaboradores (2009) testaram o efeito do extrato de Salvia officinalis L. em diferentes concentrações sobre o crescimento micelial do Penicillium spp., detectando que à medida que se aumentou a concentração do extrato aplicado ao meio de cultivo, reduziu-se, progressivamente, o crescimento micelial.
Os resultados indicam uma eficiência diminuída do agente clorado em relação ao óleo essencial, visto que a CIM foi maior para o VG frente a uma cepa de linhagem mais resistente. Para Morato e colaboradores (2009) existe a necessidade de uma frequente avaliação dos desinfetantes para a mensuração de sua atividade antimicrobiana, sendo importante a realização de ensaios que avaliem adequadamente o tipo e a origem da estirpe que está sendo testada, o preparo do inóculo, o princípio ativo do produto químico e a sua respectiva concentração.
A avaliação do efeito do óleo essencial de C. zeylanicum e do VG sobre a germinação dos esporos das cepas de PAR7 e PAR12 estão sumarizadas da Tabela 2. Em todos os casos, evidenciou-se o aumento gradual do percentual de inibição à medida que a concentração dos produtos também aumentava, demonstrando o efeito inibitório dependente de concentração. Comparando-se os produtos, não foi observada nenhuma diferença entre os resultados para cada tempo isoladamente. Porém, é válido salientar que os valores das concentrações inibitórias do óleo essencial são inferiores aos respectivos valores do VG para a cepa PAR7 (Tabela 1). E dessa forma, indicando mais uma vez a maior efetividade do óleo essencial em relação ao VG, nesse caso, interferindo na germinação dos conídios. Nos resultados com a cepa PAR12, o óleo e o VG apresentaram semelhante poder inibitório sobre a germinação dos conídios, pois, não foi observada nenhuma diferença entre os resultados dos produtos para cada tempo isoladamente.
Gráfico 2: Efeitos do óleo essencial (OE) de C. zeylanicum e do produto Vega® (VG) no crescimento micelial radial de
PAR12. a: p<0,05 quando comparado ao controle, em 12 dias de interação.
Considerando as características de disseminação, resistência de esporos e patogenicidade, o problema assume uma importância expressiva quando os produtos contaminados são destinados a milhares de pessoas, diariamente, como é o caso de restaurantes de instituições ou indústrias (MENDES, et al., 2004). Segundo Mendes (2004) nesses locais, a grande quantidade de alimentos produzidos passa, frequentemente, por lentas operações de resfriamento ou por períodos de espera, pós-cozimento, suficientemente longos para permitir que as populações microbianas alcancem níveis perigosos. Tal consideração ressalta a importância de se identificar os pontos do ambiente que possam representar fontes de contaminação, de forma a orientar medidas efetivas de controle do patógeno, principalmente, ações corretivas em processos de higienização.
Tabela 5: Percentual de inibição da germinação dos esporos de PAR7 e PAR12 após 24h de interação com o óleo essencial de C. zeylanicum e o VG.
Fungos OE VG
CIM/4 CIM/2 CIM CIMx2 CIM/4 CIM/2 CIM CIMx2
PAR7 66,7 77,7 92,6 94,6 52,7 60,8 81,8 82,2
PAR12 45,4 77,8 90,0 90,7 59,1 81,6 84,6 90,9
Nos experimentos realizados por Carmo e colaboradores (2008) o óleo essencial de C. zeylanicum apresentou um intenso efeito de supressão da germinação de esporos da espécie Aspergillus testada. Os resultados encontrados, nesta pesquisa, demonstram uma atividade de inibição da germinação dos esporos relacionada à concentração, sendo o óleo mais efetivo que o composto clorado com PAR7 (cepa mais sensível) e apresentando uma atividade semelhante ao composto clorado VG, quando do uso da PAR12.
Cinamaldeído, linalol, eugenol e 1,8 cineol têm sido relatados como componentes ativos presentes no óleo essencial de Cinnamomum spp. com capacidade de inibir o crescimento de Monilia, Botrytis e Mucor (GOUBRAN et al., 1993).
Os esporos bacterianos podem resistir aos agentes químicos usados no procedimento de higienização. Estes esporos, muitas vezes, alteram o produto ou dão origem às doenças alimentares, ocasionando riscos a saúde do consumidor. Os microrganismos esporulantes estão amplamente disseminados no ar, água, matérias-primas, ingredientes, manipuladores e, consequentemente, nas superfícies de equipamentos e utensílios de linhas de processamento (MORAES et al., 1997).
Portanto, torna-se fundamental monitorar este tipo de contaminação buscando alternativas seguras para sua eliminação ou controle na linha de produção de alimentos evitando, assim, prejuízos financeiros para indústrias e possíveis agravos à saúde do consumidor.
Despontando assim, a utilização do OE de C. zeylanicum como uma alternativa segura e viável na redução da carga fúngica do gênero Penicillium, contaminante majoritário detectado no ar ambiente.
Os resultados encontrados indicam:
Os contaminates detectados no ar da linha de produção da indústria de alimentos foram: Penicillium spp. (71,7%), Aspergillus flavus (12,8%), Aspergillus niger (12,1%), FNE (1,5%), Rhizopus spp. (1,4%), Scopulariopssis brevicaulis (0.25%) e Rhodothorula rubra (0,12%), Acremonium spp.(0,12%).
Na triagem microbiologica para avaliação do potencial antifúngico dos óleos essenciais sobre gênero majoritário Penicillium, os resultados encontrados indicam quatro óleos essenciais como possíveis agentes antifúngicos, sendo eles, S. aromaticum C. citratus, C.zeylanicum e O.vulgare.
Dentre os OE testados, o de C. zeylanicum apresentou maior efeito inibitório sobre o crescimento das cepas de Penicillium, onde a média dos halos de inibição foi 42mm de diâmetro;
A Concentração Inibitória Mínima encontrada para o OE de C. zeylanicum foi de 216 µg/mL para cepas sensíveis e 512 µg/mL para cepas resistentes, resultado semelhante com o produto químico VEGA® solução clorada utilizado como padrão;
Os experimentos revelaram também uma atuação significativa do OE na inibição do crescimento micelial e inibição da formação de esporos em comparação ao VEGA®;
Na avaliação final dos resultados foi observado que o efeito antifúngico do óleo essencial de C. zeylanicum foi superior ao sanitizante VEGA®.
O OE de C. zeylanicum aparece como uma excelente alternativa a ser utilizada na gestão de qualidade das indústrias de alimentos frente à contaminação com Penicillium spp.
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