4. MATERYAL ve METOT
4.2. Epilobium hirsutum L Doku Kültürü Deneyleri
Doku kültürü deneylerinde, Murashige ve Skoog 1962 (MS) besin ortamı esas alınmış ve bu besin ortamı çeşitli büyüme düzenleyicileri ile birlikte çimlenme, rejenerasyon ve köklenme deneylerinde kullanılmıştır (Çizelge 4.1.).
Deneylerde kullanılan magenda kapları, cam kavanoz, pens, bisturi sapı, kağıt peçete gibi malzemeler 121 oC’de ve 1,1 atm basınç altında 20 dakika otoklavlanarak steril edilmiştir. 1 litre
MS besin ortamı için 4,33 g/L MS Basal salt, 0,103 g/L MS vitamin ve 30 g/L sükroz tartılarak 1 L ultra saf suda çözdürülmüştür. Hazırlanan solüsyonun pH’sı 1 M HCl ya da 1 M NaOH’ten ilave edilerek 5,7 ile 5,8 arasına ayarlanmıştır. Bu besin ortamına 7 g/L agar eklenerek ortam tamamen çözünene kadar ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda karıştırılmıştır ve kültür kaplarına dökülmüştür. Daha sonra buzdolabı poşetlerine koyulup üzerlerine otoklav bandı yapıştırılan besin ortamları 121 oC’de ve 1,1 atm basınç altında 20 dakika süresince otoklavda sterilize
edilmiştir. Yüksek sıcaklıkta yapısı bozulan bazı hormonların sterilizasyonu (Giberellik asit GA3
vb.) milipor filtre yardımıyla yapıldıktan sonra otoklavdan çıkarılan besin ortamına ilave edilmiştir.
Çizelge 4.1. Murashige ve Skoog (MS) besin ortamı (mg/L) (Murashige ve Skoog 1962).
İnorganik maddeler MS(mg/L)
Amonyum nitrat NH4NO3 1650
Kalsiyum klorür CaCl2.2H2O 440
Magnezyum sülfat MgSO4.7H2O 370
Potasyum dihidrojen fosfat KH2PO4 170
Potasyum nitrat KNO3 1900
Borik asit H3BO3 6,2
Kobalt klorür CoCl2.6H2O 0,025
Bakır sülfat CuSO4.5H2O 0,025
Mangan sülfat MnSO4.4H2O 22,3
Potasyum iyodür KI 0,83
Sodyum molibdat Na2MoO4.2H2O 0,25
Çinko sülfat ZnSO4.4H2O 8,6
Sodyum EDTA Na2EDTA 37,3
Demir sülfat FeSO4.7H2O 27,8
Organik maddeler Glisin 2,0 Myo-inositol 100 Nikotinik asit 0,5 Piridoksin.HCl 0,5 Thiamin. HCl 0,1 Sükroz 30 g/l
In vitro çalışmaların hepsi steril kabin içerisinde yapılmıştır. Çalışmaya başlamadan hemen önce steril kabinin tüm iç yüzeyi % 70’lik etanol ile temizlenmiştir. Steril kabin içerisinde bulunan Ultra Viyole (UV) ışın lambası her çalışma öncesinde 30 dakika açık tutularak kabin içi sterilize edilmiştir (Şekil 4.8.).
Şekil 4.8. Sterilizasyon kabininin görüntüsü.
4.2.2. İklimlendirme koşulları
Kültürler, 16 saat aydınlık, 8 saat karanlıkta ve 25 oC’de 16/8 saat fotoperiyotda
iklimlendirme kabinine bırakılmıştır. Kabin içi ışık yoğunluğu raf başına 20 000 lüx’tür. Nem oranı ise % 60 olarak ayarlanmıştır. DAIHAN markalı WGC-450 model bitki büyütme kabini kullanılmıştır (Şekil 4.9.).
4.2.3. Tohumların sterilizasyonu ve in vitro çimlendirilmesi
Tohumların sterilizasyonu, sterilizasyon kabininde birkaç damla tween-20 ilave edilmiş % 30’luk çamaşır suyunda 10 dakika bekletildikten sonra steril saf suda 10’ar dakika süreyle 3 kez tutularak yapılmıştır. Çimlendirme çalışmalarında besin ortamı olarak bitki büyüme düzenleyicileri (BBD) içermeyen MS besin ortamı kullanılmıştır. Bu sebeple MS besin ortamını içeren kavanozlar veya magenda kapları içerisine 10’ar adet E. hirsutum tohumu ekilmiştir. Yüzde çimlenme durumu, çimlenme hızı ve çimlenme süresi (gün) ekimi takiben günlük olarak kontrol edilmiş ve 15 gün boyunca çimlenen tohumların sayımı yapılmıştır. Sonuçlar maksimum çimlenmenin olduğu 2. hafta sonunda elde edilen değerlerdir. Kültür kapları yukarıda belirtildiği şekilde ve şartlarda bitki büyütme dolabına eşit aralıklarla dizilmiştir. Çimlenen tohumlar 30 gün sonunda BBD içeren besin ortamına aktarılmıştır.
4.2.4. Eksplantların hazırlanması ve sürgün oluşturulması
In vitro ortamda çimlendirilen bitkilerin sürgün ucundan yaklaşık 0,3-0,5 mm’lik bir kısmı steril bistüri yardımıyla kesilerek 25, 50 ve 75 mg GA/L içeren besin ortamlarına aktarılmıştır. GA besin ortamında 3 hafta bırakılan E. hirsutum fideleri, 3 haftanın ardından içerisinde farklı konsantrasyonlarda BAP (Benzil Adenin Pürin), NAA (Naftalen Asetik Asit) ve IBA (Indole-3 Bütirik Asit) içeren MS ortamlarına aktarılmıştır.
Sürgün oluşumu ve çoğaltımı aşamalarında kullanılan besin ortamları aşağıda verilmiştir: 1. MS inorganikler+MS organikler+25 mg GA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar
2. MS inorganikler+MS organikler+50 mg GA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 3. MS inorganikler+MS organikler+75 mg GA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar
4. MS inorganikler+MS organikler+1 mg BAP/L; 0,1 mg NAA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 5. MS inorganikler+MS organikler+1 mg BAP/L; 0,5 mg NAA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 6. MS inorganikler+MS organikler+1 mg BAP/L; 1 mg NAA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 7. MS inorganikler+MS organikler+1 mg BAP/L; 0,1 mg IBA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 8. MS inorganikler+MS organikler+1 mg BAP/L; 0,5 mg IBA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 9. MS inorganikler+MS organikler+1 mg BAP/L; 1 mg IBA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar
GA ve büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamlarında 4 hafta boyunca yetiştirilen fidelerin, kök ve sürgün sayıları sayılmış ve kök ve sürgün uzunlukları ölçülmüştür.
4.2.5. Sürgünlerin köklendirilmesi
BBD içeren MS besin ortamında yetiştirilerek elde edilen E. hirsutum sürgünlerinin kök oluşumunu sağlamak için fideler farklı konsantrasyonlarda NAA ve IBA içeren MS kök ortamına aktarılmıştır. 4 hafta boyunca NAA ve IBA içeren kök ortamlarında inkübe edilmişlerdir.
Köklendirme ortamı olarak aşağıda verilen besin ortamları kullanılmıştır: 1.MS inorganikler+MS organikler+0,5 mg NAA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 2.MS inorganikler+MS organikler+1 mg NAA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 3.MS inorganikler+MS organikler+0,5 mg IBA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar 4. MS inorganikler+MS organikler+1 mg IBA/L+30 g/L sükroz+7 g/L agar
4 hafta sonunda E. hirsutum fidelerinin kök sayıları ve sürgün sayıları kaydedilmiştir.
4.2.6. E. hirsutum fidelerinin su kültürüne adaptasyonu
Yukarıda anlatılan aşamaları tamamlayan E. hirsutum fidelerinin dış ortama adaptasyonunu sağlamak için ilk olarak Magenda kaplarının içerisine % 10’luk Hoagland solüsyonu koyulmuş ve E. hirsutum fidesi kökleri solüsyona değecek şekilde sabitlenmiştir. Magenda kaplarının etrafına köklerin ışık geçirmemesi için alüminyum folyo ile kapatılmıştır. Sabitlenen E. hirsutum fidesinin üzerine şeffaf bir poşet geçirilmiş ve üzerine bir kalem yardımı ile birkaç açıklık oluşturulmuştur. Poşetin sabit kalması için magenda kabının etrafına bir lastik geçirilmiştir ve bitki büyütme kabini içerisine koyulmuştur. Düzenli olarak su kültüründe bulunan hava motoru yardımıyla solüsyonun havalanması sağlanmıştır. Her geçen gün poşet üzerindeki açıklık sayısı arttırılmıştır. 8-9 gün içerisinde poşet tamamen çıkartılmıştır ve bitki dış ortama adapte edilmiştir (Şekil 4.10.).
Şekil 4.10. E. hirsutum fidelerinin dış ortama adaptasyonu.