Epilobium hirsutum L. BİTKİSİNİN FİTOREMEDİASYON KAPASİTESİNİN ARAŞTIRILMASI ve IN VITRO ŞARTLARDA ÇOĞALTIMI
Nergiz ERDAŞ
Kütahya Dumlupınar Üniversitesi
Lisansüstü Eğitim Öğretim ve Sınav Yönetmeliği Uyarınca Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında
YÜKSEK LİSANS TEZİ Olarak Hazırlanmıştır.
Danışman Dr. Öğr. Üyesi Nüket Akanıl BİNGÖL Ortak Danışman Dr. Öğr. Üyesi Betül AKIN
KABUL VE ONAY SAYFASI
" Nergiz ERDAŞ tarafından hazırlanan "Epilobium hirsutum L. Bitkisinin Fitoremediasyon Kapasitesinin Araştırılması ve In Vitro Şartlarda Çoğaltımı " adlı tez çalışması, aşağıda belirtilen jüri tarafından Dumlupınar Üniversitesi Lisansüstü Eğitim Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin ilgili maddeleri uyarınca değerlendirilerek OY BİRLİĞİ / OY ÇOKLUĞU ile Dumlupınar Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir."
19/07/2019
Prof. Dr. Önder UYSAL …………..
Enstitü Müdürü, Fen Bilimleri Enstitüsü
Prof. Dr. Hayri DAYIOĞLU …………..
Anabilim Dalı Başkanı, Biyoloji Anabilim Dalı
Dr. Öğr. Üyesi Nüket AKANIL BİNGÖL …………..
Danışman, Biyoloji Anabilim Dalı
Dr. Öğr. Üyesi Betül AKIN …………..
Ortak Danışman, Biyoloji Anabilim Dalı, Kütahya Dumlupınar Üniversitesi
Sınav Komitesi Üyeleri
Prof. Dr. İsmail KOCAÇALIŞKAN …………..
Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Yıldız Teknik Üniversitesi
Dr. Öğr. Üyesi Nüket Akanıl BİNGÖL …………..
Biyoloji Bölümü, Kütahya Dumlupınar Üniversitesi Dr. Öğr. Üyesi Ferda ÖZMAL
ETİK İLKE VE KURALLARA UYGUNLUK BEYANI
Bu tezin hazırlanmasında Akademik kurallara riayet ettiğimizi, özgün bir çalışma olduğunu ve yapılan tez çalışmasının bilimsel etik ilke ve kurallara uygun olduğunu, çalışma kapsamında teze ait olmayan veriler için kaynak gösterildiğini ve kaynaklar dizininde belirtildiğini, Yüksek Öğretim Kurulu tarafından kullanılmak üzere önerilen ve Kütahya Dumlupınar Üniversitesi tarafından kullanılan İntihal Programı ile tarandığını ve benzerlik oranının % …. çıktığını beyan ederiz. Aykırı bir durum ortaya çıktığı takdirde tüm hukuki sonuçlara razı olduğumuzu taahhüt ederiz.
Epilobium hirsutum L. BİTKİSİNİN FİTOREMEDİASYON KAPASİTESİNİN ARAŞTIRILMASI ve IN VITRO ŞARTLARDA ÇOĞALTIMI
Nergiz ERDAŞ
Biyoloji, Yüksek Lisans Tezi, 2019
Tez Danışmanı: Dr. Öğr. Üyesi Nüket Akanıl BİNGÖL Ortak Danışman: Dr. Öğr. Üyesi Betül AKIN
ÖZET
Bu çalışmada, çinkonun Epilobium hirsutum bitkisinin kök ve gövde büyümesi, yaprak sayısı ve taze ağırlığı olmak üzere büyüme parametreleri üzerine etkisi ve bitkinin çinkonun fitoremediasyonundaki kullanılabilirliği araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, Zn konsantrasyonu ile bitkinin kök uzunluğu, gövde uzunluğu, yaprak sayısı ve taze ağırlığı arasında istatistiksel olarak negatif bir ilişki olduğu tespit edilmiştir (r= 0,75; r= 0,74; r= 0,84 ve r= -0,86, sırasıyla). Ayrıca, E. hirsutum bitkisinin en iyi gelişim gösterdiği Zn konsantrasyonun 30 mg/L olduğu bulunmuştur. Farklı çinko konsantrasyonlarında yetiştirilen E. hirsutum fidelerinin akümüle ettiği çinko miktarları karşılaştırıldığında ise, 30 mg Zn/L konsantrasyonunda yetiştirilen fidelerin en fazla çinkoyu akümüle ettiği bulunmuştur (14 894,90 mg/kg). Ayrıca, pH 6'nın, 30 mg/L çinko içeren çözeltide yetiştirilen fideler için en iyi pH seviyesi olduğu tespit edildi. Çinko analiz sonuçları, bitki dokularında Zn dağılımının, kökte 50 813.89 mg/kg, sürgünde 4173.88 mg/kg ve yaprakta 697.0 mg/kg olduğunu göstermiştir.
Bitki doku kültürü çalışmalarının amacı, E. hirsutum bitkisinin doku kültürü yöntemleri ile çoğaltılması ve su kültürü koşullarına en uygun adaptasyon koşullarının belirlenmesidir. In vitro çimlendirilen tohumlardan elde edilen fideler mikroçoğaltımda eksplant kaynağı olarak kullanılmıştır. E. hirsutum türünde sürgün oluşturmada en başarılı ortamların 1 mg BAP/L+1 mg NAA/L ve 1 mg BAP/L+1 mg IBA/L içeren besin ortamları olduğu tespit edilmiştir. En yüksek kök oluşumu ise 1 mg IBA/L (32,9±6,71 kök sayısı/eksplant) içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. Köklenen sürgünler su kültürü ortamına başarılı bir şekilde aktarılmış ve fidelerin bu ortama adaptasyonu sağlanmıştır.
INVESTIGATION of PHYTOREMEDIATION CAPACITY OF Epilobium hirsutum L. AND ITS PROPAGATION UNDER IN VITRO CONDITIONS
Nergiz ERDAŞ Biology, M.S. Thesis, 2019
Thesis Co-Advisor: Assist. Prof. Dr. Nüket Akanıl BİNGÖL Co-Supervisor: Assist. Prof. Dr. Betül AKIN
SUMMARY
In this study, the effect of zinc on growth parameters of Epilobium hirsutum (root and stem growth, number of leaves and fresh weight) and its usability in the phytoremediation of zinc were investigated. According the results, it was found that there was a statistically negative correlation between Zn concentration and root length, shoot length, number of leaves and fresh weight of the plant (r= -0.75; r= -0.74; r= -0.84 and r= -0.86, respectively). Also, the zinc concentration that E. hirsutum showed the best development was found as 30 mg/L. When the zinc content of E. hirsutum seedlings grown at different zinc concentrations were compared, it was found that the seedlings grown at 30 mg Zn/L concentration accumulated the maximum zinc (14 894,90 mg/kg). Moreover, it was determined that pH 6 was best pH level for seedlings grown in solution containing 30 mg/L zinc. Results of zinc analyzes indicated that distribution of Zn in plant tissues were 50 813.89 mg/kg DW in the root, 4173.88 mg/kg DW in the shoot and 697.0 mg/kg DW in the leaf.
The aim of the plant tissue culture studies was to propagation of E. hirsutum plant with tissue culture methods and to determine the most suitable adaptation conditions to water culture conditions. Seedlings, obtained from in vitro germinated seeds, were used as explant sources in micropropagation studies. It was determined that the most successful medium for shoot regeneration were 1 mg BAP/L +1 mg NAA/L and 1 mg BAP/L+1 mg IBA/L for E. hirsutum species. The highest root formation was obtained in MS medium containing 1 mg IBA/L (32.9±6.71 root number/explant). Shoots which developed roots were transferred to water culture medium successfully and plantlets were adapted to the water culture medium.
TEŞEKKÜR
Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları aşmak için bilgi ve tecrübesini benden esirgemeyen, bana daima yol gösteren, değerli Danışman hocalarım Dr. Öğr. Üyesi Nüket Akanıl BİNGÖL ve Dr. Öğr. Üyesi Betül AKIN’a teşekkürlerimi sunarım.
Araştırmanın laboratuvar çalışmaları kısmında bana yardımcı olan değerli abim Onur MEŞELİ’ye, tez süresince manevi desteklerini hep üzerimde hissettiğim can arkadaşım Hilal BİRİNCİ’ye ve sevgili hocam Araş. Gör. Dr. Ece Gökçe Çakır DİNDAR’a, teknik yardımlarından dolayı Orman Yüksek Mühendisi Aslan MERDİN’e ve değerli arkadaşım Doktora Öğrencisi Mehmet GÜLMEZ’e teşekkürü bir borç bilirim.
Tez çalışmamda 2237-A kapsamında desteklenen TÜBİTAK 1059B291700039 kodlu “Biyolojik Çeşitlilik Ölçüm Süreçleri: Envanter, Veri Transferi ve Hesaplama Teknikleri”, 1059B291700280 kodlu “Analitik Doğa- Kümeleme ve Ordinasyon Teknikleri” ve 1059B291700839 kodlu “Doğal Ekosistemler İçin CBS ve Uydu Görüntüleri Kullanılarak Çevresel Altlıkların Hazırlanması” projelerine katkılarından dolayı teşekkür ederim.
Bu yaşıma kadar benden hiçbir şekilde maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen ve bana daima inanan başta canım babam Hasan ERDAŞ’a, canım annem Eşe ERDAŞ’a, ablam Necmiye Erdaş BALA’ya, eniştem Himmet BALA’ya ve kardeşim İbrahim Mert ERDAŞ’a minnettarım.
Nergiz ERDAŞ KÜTAHYA, 2019
İÇİNDEKİLER
Sayfa ÖZET ... v SUMMARY ...vi ŞEKİLLER DİZİNİ ... x ÇİZELGELER DİZİNİ ... xii 1. GİRİŞ ... 11.1. Problem Durumu/ Konunun Tanımı ... 1
1.2. Araştırmanın Amacı ... 1
1.3. Araştırmanın Önemi ... 2
2. FİTOREMEDİASYON ÇALIŞMALARI ... 3
2.1. Ağır Metaller ve Ağır Metal Kirliliği ... 5
2.2. Atık Suların Temizlenme Yöntemleri ... 5
2.2.1. Fiziksel arıtma yöntemleri ... 6
2.2.2. Kimyasal arıtma yöntemleri... 6
2.2.3. Biyolojik arıtma yöntemleri ... 6
2.2.3.1. Fitoremediasyon tipleri ... 7
2.3. Çinko (Zn) Ağır Metali ve Bitkiler İçin Önemi ... 10
3. DOKU KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI ... 13
4. MATERYAL ve METOT ... 19
4.1. Epilobium hirsutum L. Fitoremediasyon Deneyleri ... 19
4.1.1. E. hirsutum tohumlarının toplanması ... 20
4.1.2. E. hirsutum tohumlarının çimlendirilmesi ve yetiştirilmesi ... 20
4.1.3. E. hirsutum fidelerinin hidroponik ortama adaptasyonu ... 22
4.1.4. Fitoremediasyon deneyleri ... 23
4.1.5. Ağır metal analizleri ... 24
4.2. Epilobium hirsutum L. Doku Kültürü Deneyleri ... 25
4.2.1. Besin ortamları, hazırlanışı ve sterilizasyonu ... 25
İÇİNDEKİLER(devam)
Sayfa
4.2.3. Tohumların sterilizasyonu ve in vitro çimlendirilmesi ... 28
4.2.4. Eksplantların hazırlanması ve sürgün oluşturulması ... 28
4.2.5. Sürgünlerin köklendirilmesi ... 29
4.2.6. E. hirsutum fidelerinin su kültürüne adaptasyonu ... 29
4.3. İstaistiksel Analizler ... 30 5. BULGULAR ... 31 5.1. Fitoremediasyon Çalışmaları ... 31 5.2. Doku Kültürü Çalışmaları ... 35 6. TARTIŞMA ... 41 KAYNAKLAR DİZİNİ ... 47 ÖZGEÇMİŞ
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
2.1. Yeryüzündeki tatlı ve tuzlu suların dağılımı ... 3
4.1. Epilobium hirsutum genel görünümü. ... 19
4.2. Epilobium hirsutum kapsülünün genel görünüşü. ... 20
4.3. E. hirsutum tohumunun genel görünüşü. ... 21
4.4. Viyoller içerindeki 8-10 yapraklı E. hirsutum fideleri. ... 22
4.5. Adaptasyon aşamasındaki E. hirsutum fideleri. ... 22
4.6. Kurutma işlemi için hazırlanan E. hirsutum örnekleri. ... 24
4.7. Örneklerin yakılması. ... 25
4.8. Sterilizasyon kabininin görüntüsü. ... 27
4.9. İklimlendirme kabininin genel görünüşü. ... 27
4.10. E. hirsutum fidelerinin dış ortama adaptasyonu. ... 30
5.1. Farklı çinko konsantrasyonlarında yetiştirilen E. hirsutum fidelerine ait (a) kök ve (b) gövde uzunlukları, (c) yaprak sayıları ve (d) taze ağırlıkları (ortalama ve standart hata). .. 31
5.2. Uygulanan farklı çinko konsantrasyonları ile E. hirsutum fidelerinin büyüme parametreleri arasındaki korelasyon. ... 33
5.3. 30 mg Zn/L içeren farklı pH konsantrasyonları ile Epilobium hirsutum büyüme parametreleri arasındaki korelasyon. ... 34
5.4. Bitkinin en iyi gelişim gösterdiği konsantrasyon ve pH’da (30 mg Zn/L pH=6) yetiştirilen fidelerin kök, gövde ve yapraklarının akümüle ettiği Zn miktarının karşılaştırıldığı TUKEY-HSD sonuçları (Q=3,07; p < 0,05). ... 35
5.5. (A) MS besin ortamına ekimi yapılan E.hirsutum tohumları. (B) 4 hafta sonunda MS besin ortamında yetişen E. hirsutum fideleri. ... 36
5.6. (A) 25 mg GA/L’de yetiştirilen E. hirsutum fideleri (B) 50 mg GA/L’de yetiştirilen E. hirsutum fideleri (C) 75 mg GA/L’de yetiştirilen E. hirsutum fideleri. ... 37
5.7. (A) E. hirsutum bitkisinin en iyi gelişim gösterdiği 1 mg BAP/L+1 mg NAA /L bulunan ortamda oluşan sürgünlerine ait görünüm, (B) E. hirsutum bitkisinin en iyi gelişim gösterdiği 1 mg BAP/L+1 mg IBA/L bulunan ortamda oluşan sürgünlerine ait görünüm. . 39
ŞEKİLLER DİZİNİ (devam)
Şekil Sayfa
5.8. (A) 1 mg BAP/L+1 mg IBA/L sürgün ortamından, 1 mg IBA/L kök ortamına aktarılan E. hirsutum bitkisinin köklerine ait görünüm. (B) 1 mg BAP/L+1 mg NAA/L sürgün ortamından 1 mg IBA/L kök ortamına aktarılan E. hirsutum bitkisinin köklerine ait
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge Sayfa
2.1. Atık suların temizlenmesinde kullanılan temizlenme yöntemleri ... 6
2.2. Ni, Cd, As, Cu, Zn, Pb, Cr ve Mn’ı akümüle edebilen bitkiler. ... 9
3.1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar... 14
4.1. Murashige ve Skoog (MS) besin ortamı (mg/L) ... 26
5.1. Farklı Zn konsantrasyonlarında yetiştirilen E. hirsutum fidelerinin akümüle ettiği Zn miktarları (mg/kg). ... 33
5.2. 30 mg Zn/L içeren farklı pH’lara sahip çözeltilerde yetiştirilen E. hirsutum fidelerine ait (a) kök ve (b) gövde uzunlukları (cm), (c) yaprak sayıları ve (d) taze ağırlıkları (g) (ortalama ± standart hata). ... 34
5.3. MS besin ortamının E. hirsutum bitkisinde çimlenme ve fide gelişimi üzerine etkisi (ortalama ± standart hata). ... 36
5.4. MS besin ortamından farklı konsantrasyonlarda GAiçeren besin ortamına aktarılan fidelerin sürgün ucu eksplantlarının sürgün, kök ve yaprak sayısı parametreleri üzerine etkisi (ortalama ± standart hata). ... 37
5.5. 50 mg GA/L içeren MS besin ortamında yetiştirilen fidelerden eksplant alınan E. hirsutum bitkisinin büyüme parametreleri üzerine BAP+NAA ve BAP+IBA bitki büyüme düzenleyicilerinin etkileri (ortalama ± standart hata). ... 38
5.6. 1 mg BAP/L+1 mg NAA/L ve 1 mg BAP/L+1 mg IBA/L ortamlarından alınan sürgün uçlarının köklendirilmesi üzerine farklı konsantrasyonlarda kök büyüme düzenleyicilerinin (0,5 NAA, 1 NAA, 0,5 IBA ve 1 IBA) etkileri (ortalama ± standart hata). ... 40
1. GİRİŞ
1.1. Problem Durumu/ Konunun Tanımı
Günümüzde hızlı nüfus artışı, doğal kaynakların plansız kullanımı ve sanayileşmenin neden olduğu su kirliliği ciddi bir çevre problemi olup, temiz su kaynaklarının kirlenmesine sebep olmaktadır. Temiz su kaynaklarının devamlılığını sağlamak için, endüstride, tarımsal faaliyetlerde ve kentsel su kullanımlarının sebep olduğu su kayıplarının önüne geçilmesi ve atık suların kalitesinin arttırılması gerekmektedir. Bundan dolayı suların çeşitli yöntemlerle temizlenmesine yönelik yapılan çalışmalar her geçen gün hız kazanmaktadır. Son yıllarda özellikle sulardan ağır metal kirliliğinin (As, B, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Se, Zn v.b) giderilmesi için farklı araçların kullanıldığı adsorpsiyon, biyosorpsiyon, remediasyon ve fitoremediasyon yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır.
Fitoremediasyon yönteminin çeşitli uygulamaları için hangi bitkinin hangi kirleticileri ortamdan uzaklaştırabileceği üzerine birçok çalışma yapılmıştır. Bu kirleticilerden biri olan Zn, Kütahya il sınırları içinde bulunan akarsu ve göllerde yüksek konsantrasyonlarda bulunmaktadır. Mali getirisi yüksek olan Zn, maden sanayi ve porselen sanayi kaynaklı olarak Kütahya’nın tatlı sularına karışmaktadır. Zn kirliliğini gidermek için farklı ülkelerde Eleocharis acicularis, Alternanthera philoxeroides, Zizania latifolia, Echinochloa crus-galli, Polygonum hydropiper, Isachine globosa, Digitaria sanguinalis ve Fimbristylis miliacea, Eichhornia crassipes, Potamogeton crispus, Phragmites australis, Thlaspi caerulescens bitkileri kullanılmış ve bu bitkilerin Zn’yu bünyelerinde tuttuğu tespit edilmiştir.
1.2. Araştırmanın Amacı
Bu tezin amacı, çinkonun Epilobium hirsutum bitkisinin kök ve gövde büyümesi, yaprak
sayısı ve taze ağırlığı olmak üzere büyüme parametreleri üzerine etkisi ve bitkinin çinkonun fitoremediasyonundaki kullanılabilirliğini araştırmaktır. Bu çalışmada ayrıca, Epilobium
hirsutum L. türünün farklı çinko konsantrasyonlarına olan toleransı ve farklı seviyelerde pH’nın etkisi belirlenecektir. Yapılan çalışmalar sonucunda, bitkinin hangi organında Zn’nun (kök, gövde veya yaprak) daha fazla biriktirdiği hesaplanacak ve Epilobium hirsutum’un yapay sulak alanlarda Zn’nun temizlenmesinde kullanılabilirliği ortaya konulacaktır. Ayrıca bitkinin doku kültürü yöntemleri ile üretimi sağlanacak ve bu çalışmadan elde edilecek veriler ileride yapılacak fitoremediasyon çalışmalarında öncü bir çalışma niteliğinde olacaktır.
1.3. Araştırmanın Önemi
Ağır metallerle kontamine olmuş suların temizlenmesinde kullanılan yöntemlerden biri olan fitoremediasyon tekniği, hem çevre dostu bir yöntem olması hem de maliyetinin çok düşük olması sebebiyle bilim insanlarının dikkatini çekmiş ve bu konu üzerine yapılan çalışmalar günümüzde giderek hız kazanmıştır. Bu tekniğin başarısındaki önemli hususlardan biri atığa uygun toleranslı bitki türünün belirlenmesidir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar doğrultusunda, Epilobium hirsutum bitkisinin çinkonun fitoremediasyonunda ve yapay sulak alanlarda kullanılabilirliliği ortaya konulacak ve suların çinko kirliliğinin önüne geçilmeye çalışılacaktır. Aynı zamanda bitki doku kültürü yöntemleri ile çoğaltılacak ve ileride yapılacak çalışmalarda kullanılmak üzere bitkinin in vitro protokolü oluşturulacaktır.
2. FİTOREMEDİASYON ÇALIŞMALARI
Yaşamın temel unsurlarından biri olan su, iki hidrojen ve bir oksijen molekülünden oluşan, normal koşullar altında sıvı, saydam, tatsız ve kokusuz bir besin maddesidir. Yaşamın vazgeçilmez bir parçası olması nedeni ile su günümüzde önemi gittikçe artan stratejik bir doğal kaynak halini almıştır (Özsoy, 2009). Dünyanın oluşumundan bu yana suyun katı halden sıvıya, sıvıdan gaza, gazdan da tekrar sıvıya ve katıya çevrimi sürekli bir döngü halindedir. Su Döngüsü (Hidrolojik Çevrim) olarak adlandırılan bu olay, okyanus, deniz ve göl gibi su kütlelerinin bünyesindeki suyun güneşten gelen ısı ile birlikte buharlaşarak gaz haline geçmesi ve tekrar yeryüzüne yağış olarak inmesi şeklinde tanımlanmaktadır (Aydın vd., 2013: 41).
Yer kürenin % 75’i sularla kaplıdır. Bu toplam suyun % 96,6’sı okyanus ve denizlerde tuzlu su olarak bulunurken, kalan % 3,4’ü ise tatlı su şeklindedir. Kullanılabilir tatlı sularımızın % 69,30’u buzullarda tutulurken, % 30,32’si yer altı sularında, % 0,35 yüzey sularında ve % 0,04’ü de göller, bataklıklar ve nehirlerde tutulmaktadır (Şekil 2.1) (Akın ve Akın, 2007; Aydın vd., 2013: 43-44).
Ülkeler mevcut kullanılabilir su miktarlarına göre su fakiri ülkeler, su azlığı çeken ülkeler ve su zengini ülkeler olarak gruplandırılmaktadır. Yıllık kişi başına düşen kullanılabilir su miktarı 1000 m3’den az olan ülkeler su fakiri ülkeler, 1000-2000 m3 arasında olan ülkeler su sıkıntısı
çeken ülkeler ve 2000 m3’ten fazla olan ülkeler ise su zengini ülkeler olarak sınıflandırılmaktadır.
Ülkemiz su kaynakları potansiyeline bakıldığında, kullanılabilir yer altı ve yerüstü su potansiyelimiz 112 milyar m3’tür (Demir vd., 2017). Ülkemizdeki bu mevcut suyun % 73’ü
sulamada, % 16’sı içme suyu ve % 11’i sanayide kullanılmaktadır. Bu veriler değerlendirildiğinde, ülkemizde kişi başına düşen su miktarı 1519 m3/yıl olup su sıkıntısı çeken
ülkeler arasında yer almaktadır (Öktem ve Aksoy, 2014). Türkiye İstatistik Kurumu [TUİK] 2018 verilerine göre, 2040 yılında Türkiye nüfusu 100 milyona ulaşacaktır. Bu öngörü değerlendirildiğinde, 22 yıl sonra ülkemizde kişi başına düşen su miktarı 1120 m3/yıl’a düşecektir
(Sertyeşilışık, 2017).
Hızlı nüfus artışı ve sanayileşme ile birlikte suyun kullanım alanları ve ihtiyaç duyulan miktarları giderek artmaktadır (Özsoy, 2009). Tüm dünyada ekonomik ve sosyal faaliyetlerin sağlıklı olarak sürdürülebilmesi için temiz suya ihtiyaç vardır. Temiz su kaynaklarının sürdürülebilirliğini sağlamak için bu kaynakları korumak su yönetiminin en temel unsurlarından biridir. Bunun için, su kaynaklarının doğru ve etkin kullanılmasının yanı sıra bazı endüstriyel, tarım ve kentsel su kullanımına bağlı su kayıplarının ve su kirliliğinin önüne geçilmesi ve atık suların kalitesinin arttırılması gerekmektedir (Aküzüm vd., 2010; Demir vd., 2017).
En önemli küresel çevre problemlerinden biri olan su kirliliği, kullanılabilir su kaynaklarının çevre ve insan sağlığını tehlikeye atan bazı kirleticiler tarafından kalitesinin değişmesi ve kullanılabilir özelliğini yitirmesi şeklinde tanımlanmaktadır. Özellikle tarım ve endüstri kaynaklı atıkların alıcı ortamlar olan tatlı sulara bırakılması, var olan su kaynaklarının kalitesinin düşmesine ve su kirliliğine neden olmaktadır (Haseena vd., 2017). World Health Organization [WHO] (2016) su kirliliğine sebep olan etmenleri, mikrobiyolojik tehlikeler, kimyasal tehlikeler, organik kirleticiler, ötrofikasyona bağlı tehlikeler, fiziksel tehlikeler ve radyolojik tehlikeler şeklinde sınıflandırmıştır. Ülkemiz yüzey sularının kirlilik nedenleri başında evsel atıklar, sanayi atıkları, zirai ilaç ve gübre kullanımı, hayvan yetiştiriciliği, madencilik faaliyetleri ve erozyon gelmektedir. Yüzey sularımızın % 27’si I. sınıf (yüksek kaliteli su), % 20’si II. sınıf (az kirlenmiş su), % 21’i III. sınıf (kirli su) ve % 33’ü IV. sınıf (çok kirlenmiş su) su kalitesine sahiptir (Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü, 2008: 62-132). Özellikle otomotiv
sanayi, deri sanayi, tekstil sanayi ve kaplama sanayi atıklarının akarsu ve göllere bırakılması, tatlı sularımızın ağır metaller tarafından kirlenmesine sebep olmaktadır (Dündar vd., 2012).
2.1. Ağır Metaller ve Ağır Metal Kirliliği
Yoğunluğu 5 g/cm3’ten yüksek, atom ağırlığı 50’den büyük olan ve periyodik cetvelde
geçiş elementleri olarak bilinen elementlere ağır metal denir. Ağır metaller kayaçların yapısında bulunur ve toprağın ana bileşenlerinden biridir (Gündüz, 1998: 130; Kocaer ve Başkaya, 2003). 70 adet element ağır metal olarak tanımlanırken, bu elementlerden 20 tanesi direk çevre ile ilgili olması nedeniyle en fazla araştırılan ağır metaller arasında yer almaktadır. Bunlar; demir (Fe), çinko (Zn), bakır (Cu), arsenik (As), kadmiyum (Cd), alüminyum (Al), mangan (Mn), molibden (Mo), vanadyum (V), kobalt (Co), nikel (Ni), krom (Cr), kurşun (Pb), berilyum (Be), talyum (Tl), antimon (Sb), selenyum (Se), kalay (Sn), gümüş (Ag) ve civa (Hg) elementleridir (Okçu vd., 2009; Rajeswari ve Sailaja, 2014).
Ağır metallerin doğadaki normal dağılımları, son zamanlarda artan antropojenik faaliyetler sonucu farklılaşmaya başlamıştır (Tchounwou vd., 2012). Ağır metal kirliliğinin başlıca kaynakları olarak nitelendirilebilecek olan endüstriyel faaliyetlerin başında çimento üretimi, demir çelik sanayi, termik santraller, cam ve porselen üretimi, çöp ve atık çamur tesisleri gelmektedir. Ağır metal içeren bu endüstrilerin atıkları çeşitli yollarla bitkilere, hayvanlara ve insanlara ulaşmakta ve bu canlılar üzerinde toksik etki göstermektedir (Okçu vd., 2009). Örneğin, çinko, kurşun ve kadmiyum toksisitesi insanlarda zihinsel, hormonal ve nörolojik olumsuzluklara, alerjik reaksiyonlara, genlerin mutasyonuna, akciğer, böbrek ve karaciğer gibi organların zarar görmesine neden olmaktadır (Kalkan vd., 2011; Çiftçi, 2016). Bu saydığımız nedenlerden dolayı, sularımızı kirleten kirleticilerin ortamdan uzaklaştırılması veya kirlilik seviyelerinin düşürülmesi için fiziksel, kimyasal ve biyolojik temizleme yöntemleri geliştirilmiş ve bu yöntemler kontaminasyona uğramış ortamların temizlenmesinde kullanılmıştır (Demir vd., 2017).
2.2. Atık Suların Temizlenme Yöntemleri
Çeşitli nedenlerle kontamine olmuş suların tekrar kullanımını sağlamak ve çevreye olan olumsuz etkilerini en aza indirmek için farklı atık su arıtma yöntemleri kullanılmaktadır. Bu yöntemler fiziksel, kimyasal ve biyolojik arıtma yöntemleridir (Çizelge 2.1.) (Kurniawan vd., 2006; Sinan, 2010; Fu ve Wang, 2011; Barakat, 2011; Gupta vd., 2012; Şener, 2016).
Çizelge 2.1. Atık suların temizlenmesinde kullanılan temizlenme yöntemleri (Kurniawan vd., 2006; Sinan, 2010; Fu ve Wang, 2011; Barakat, 2011; Gupta vd., 2012; Şener, 2016).
Fiziksel Arıtma Yöntemleri
Kimyasal Arıtma
Yöntemleri Biyolojik Arıtma Yöntemleri Izgaralar ve elekler, Koagülasyon (Pıhtılaştırma), Klasik aktif çamur (KAÇ), Öğütücü ve parçalayıcılar, Flokülasyon (Yumaklaştırma), Uzun havalandırmalı aktif
çamur (UHAÇ),
Yüzdürme havuzları, Flotasyon, Oksidasyon hendekleri,
Kum tutucular, Kristalleştirme, Damıtmalı filtreler, Çöktürme havuzları, Solvent ekstaksiyonu, Biyodisk,
Yağ ayırıcılar, Klorlama, Anaerobik sistem,
Buharlaştırma, Oksidasyon, Biyosorpsiyon,
Dengeleme havuzları, Elektroliz, Adsorbsiyon,
Filtreleme Fosfor giderme,
Azot giderme, Membranfiltrasyonu (Ultrafiltrasyon), Ters Osmoz, İyon değiştirme,
2.2.1. Fiziksel arıtma yöntemleri
Fiziksel arıtma, atık suda bulunan çökebilen ve yüzebilen farklı boyutlardaki katı maddelerin, çözünmüş organik ve inorganik maddelerin ve gazların uzaklaştırılması için fiziksel işlemlerin kullanıldığı aşamalar olarak tanımlanır. Fiziksel arıtma yöntemleri Çizelge 2.1.’de verilmiştir (Sinan, 2010; Şener, 2016).
2.2.2. Kimyasal arıtma yöntemleri
Kimyasal atık su arıtma sistemleri, özellikle endüstriyel atık sularının arıtımında yaygın olarak kullanılan bir arıtma yöntemidir. Bu sistemlerde kirleticinin tipine ve kirlilik miktarına göre belirlenen bazı kimyasal maddeler endüstriyel nitelikli atık sulara ilave edilip çeşitli tepkimelerin oluşması sağlanmakta ve kirletici maddeler ortamdan uzaklaştırılmaktadır (Çizelge 2.1.) (Şener, 2016).
2.2.3. Biyolojik arıtma yöntemleri
Özellikle evsel atık suların arıtılmasında kullanılan yöntemlerden biri olan biyolojik arıtma, organik maddelerin kısmen okside olması, kısmen de bakteriyolojik faaliyetlerle parçalanması ve en küçük yapı taşı olan inorganik bileşiklere dönüşmesi işlemidir. Biyolojik
arıtma sistemleri farklı şekillerde sınıflandırılmakla birlikte, adsorbsiyon, biyosorbsiyon, biyoremediasyon ve fitoremediasyon yöntemleri biyolojik arıtma sistemleri arasında yer almaktadır (Çizelge 2.1.). Son zamanlarda bu yöntemler ucuz maliyetli ve çevre dostu olması nedeniyle yaygın olarak kullanılmaya başlamıştır (Sinan, 2010; Hamutoğlu vd., 2012; Şener, 2016).
Adsorpsiyon, “bir maddenin diğer bir madde yüzeyinde veya iki faz arasındaki ara yüzeyde konsantrasyonunun artması ya da diğer bir ifade ile moleküllerin temas ettikleri yüzeydeki çekme kuvvetine bağlı olarak o yüzeyle birleşmesidir” (Hamutoğlu vd., 2012). Adsorpsiyon işleminde kullanılan adsorbentler inorganik ve organik olmak üzere sınıflandırılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan inorganik adsorbentler arasında zeolitler, perlit ve kil yer alırken, organik adsorbentler arasında sellüloz, reçine ve talaş bulunmaktadır (Barakat, 2011; Hamutoğlu vd., 2012; Demir ve Yalçın, 2014).
Bir diğer biyolojik arıtma yöntemi olarak bilinen biyosorpsiyon ise “bakteri, yengeç kabukları, fungus ve alg gibi biyomateryaller kullanılarak düşük konsantrasyon ve yüksek hacimli metal içeren atık suların iyileştirilmesi için uygun maliyetli biyoteknolojik bir yöntem olarak kullanılmaktadır” (Hamutoğlu vd., 2012).
Biyosorpsiyonda kullanılan ölü bitki ve hayvan kısımları genellikle organik atıklardan veya doğal kaynaklardan elde edilir ve bu yüzden maliyeti oldukça düşüktür. Yüksek maliyet gerektirmeyen ve birçok alanda uygulanabilen doğal bir yöntem olan biyoremediasyon da ise canlı bitkiler kullanılmaktadır. Bitkilerin kullanıldığı bu teknik “Fitoremediasyon Tekniği” olarak tanımlanmıştır (Yıldızhan, 2007; Hamutoğlu vd., 2012). Fitoremediasyon terimi 1991 yılından bu yana terminolojide yer almakta olup, fito bitki ve remediasyon kelimelerinden meydana gelmiştir. Çeşitli kirleticilerle kontamine olmuş toprak ve suların bitkiler yardımı ile temizlenmesi olarak tanımlanan fitoremediasyonun farklı tipleri bulunmaktadır. Bunlar; fitoekstraksiyon, fitostabilizasyon, fitodegredasyon, fitovolatilizasyon, rizofiltrasyon, rizodegredasyon, hidrolojik kontrol, vejetatif örtü ve kıyı tampon şeritleridir (Kalkan vd., 2011; Hamutoğlu vd., 2012; Yurdakul, 2015).
Fitoremediasyon tipleri
Fitoekstraksiyon, metal biriktiren bitkilerin kökleriyle toprak ve sudaki kirleticileri bünyelerine alarak gövde ve yaprak gibi toprak üstü organlarında biriktirmesi ve bitkinin hasat edilerek kirletici etmenin ortamdan uzaklaştırılması şeklide tanımlanmaktadır (Terzi ve Yıldız,
2011; Kalkan vd., 2011; Ali vd., 2013;). Bu teknik Cu, Zn, Ni, Cd, Pb ve As’in sebep olduğu, orta ve düşük derecede kirliliğin görüldüğü toprak ve sulardan bu ağır metallerin uzaklaştırılmasında kullanılmaktadır (Hamutoğlu vd., 2012; Yurdakul, 2015; Aybar vd., 2015).
Fitostabilizasyon, topraktaki toksik metalleri ortamdan uzaklaştırmak için bitkilerin kullanıldığı bir başka yöntemdir. Bu yöntemde genellikle toksik metaller bitki kökleri tarafından alınıp yine köklerde sabitlenmesiyle gerçekleşir (Hamutoğlu vd., 2012).
Fitodegredasyon; “bitkilerin enzimlerle yapısına aldığı organik bileşikleri parçalamasıdır. Parçalama, kirleticinin bitki yapısına alınımı ve taşınımı, metabolik faaliyet ve mikrobiyal faaliyet ile gerçekleşmektedir. Bu yöntemde kullanılan bitkilerin yapılarındaki farklılık bu metabolik olayların gerçekleşmesinde etkendir” (Yurdakul, 2015).
Fitovolatilizasyon; toprakta belli konsantrasyonlarda bulunan kirleticilerin bitkiler tarafından uçucu forma dönüşürülerek atmosfere verilmesi şeklinde tanımlanmaktadır. Brassicaceae familyasına ait bazı türler bu yöntem ile günde hektar başına 40 g Se’u atmosfere verebilmektedir (Hamutoğlu vd., 2012).
Rizofiltrasyon, kirlenmiş yüzey sularından veya atık sulardan bitki kökleri tarafından metal kirleticilerin alınımıdır. Eichhornia crassipes, Micranthemum umbrosum, Brassica juncea, Phaseolus vulgaris ve Helianthus annuus dahil olmak üzere bir çok bitki Cu, Cd, Cr, Ni, Pb, Zn ve U gibi toksik metallerin sucul ortamlardan uzaklaştırılmasında kullanılmaktadır (Terzi ve Yıldız, 2011; Parmar ve Singh, 2015).
Köklerle bozunum olarak da bilinen rizodegredasyon da ise, toprakta kök bölgesinde bulunan şeker, alkol, organik asit ve karbonhidrat gibi organik kökenli kirleticilerin toprak mikroorganizmaları tarafından ayrıştırılmasıdır (Hamutoğlu vd., 2012; Yurdakul, 2015).
Hidrolojik kontrolde, “yeraltı sularındaki kirliliğin iyileştirilmesinde kullanılan ağaçlar pompa gibi davranarak su içerisindeki kirleticileri kökleri ile yukarıya hareket ettirmektedir. Kavak gibi bazı ağaçlar toprakta bulunan suyun önemli bir kısmını yapılarına alma yeteneğine sahiptirler” (Yurdakul, 2015).
Vejetatif örtü, kirleticilerin toprak yüzeyinde bulunan doğal vejetasyona ait bitki türleri tarafından alınımı şeklinde tanımlanmaktadır. Kıyı tampon şeritleri ise, kontamine olmuş yeraltı ve yüzeysel suların temizlenmesi amacıyla akarsu kenarlarına bitkilerin sıra halinde ekilmesidir (Hamutoğlu vd., 2012).
Yukarıda bahsedilen bu tekniklerde kullanılan bitkiler ağır metal konsantrasyonlarının çok yüksek olduğu karasal ve sucul ekosistemler de dahi canlılıklarını sürdürebilmektedirler. Bu mekanizmaya sahip olan bitkiler “hiperakümülatör bitkiler” olarak tanımlanmaktadır (Sarma 2011; White, 2012: 7-47). Hiperakümülatör bitkiler, topraktan veya sudan bir veya birden fazla ağır metali alarak yapısında yüksek miktarlarda biriktirebilen bitkilerdir. Bu hiperakümülatör bitkilerin bazıları ağır metalleri köklerinde depolarken, bazıları bu metalleri topraküstü organlarına özellikle yapraklarına kadar taşıyabilmektedir. Hiperakümülatör bitki türleri hiperakümülatör olmayan bitki türlerine göre 100-1000 kat daha fazla ağır metali yapraklarında biriktirirler ve fitotoksik belirtiler göstermezler. Hiperakümülatör olarak bilinen yaklaşık 450 Angiosperm türü bulunmakla birlikte, ağır metalleri toplayabilen bu hiperakümülatör bitkiler tüm bitki türlerinin % 0,2'sinden daha azını oluşturmaktadır (Rascio ve Navari-Izzo, 2011) (Çizelge 2.2.).
Çizelge 2.2. Ni, Cd, As, Cu, Zn, Pb, Cr ve Mn’ı akümüle edebilen bitkiler.
Bitki Metal Metal akümülasyonu (mg/kg)
Alyssum corsicum Duby Ni 18 100
Alyssum carium Boiss. & Heldr. Ni 12 500
Alyssum heldreichii Hausskn. Ni 11 800
Alyssum markgrafii O.E.Schulz Ni 19 100
Alyssum murale Waldst. & Kit. Ni 4 730-20 100
Alyssum pterocarpum Dudley. Ni 13 500
Azolla pinnata R. Br. Cd 740
Berkheya coddii Roessler Ni 18 000
Corrigiolate lephiifolia Pourr. As 2 110
Eleocharis acicularis L.
Cu 20 200 Zn 11 200 As 1 470
Euphorbia cheiradenia Boiss & Hohen Pb 1 138
Isatis pinnatiloba P.H. Davis Ni 1 441
Pteris biaurita L. As ~2 000
Pteris cretica L. As ~1 800
2 200–3 030
Pteris quadriaurita Retz. As 2 900
Pteris ryukyuensis Tagawa As 3 647
Pteris vittata L. As 8 331
Cr 20 675
Rorippa globasa (Turcz. ex Fisch. & C.A. Mey.) Hayek Cd >100
Schima superba Gardner & Champ. Mn 62 412,3
Solanum photeinocarpum Nakamura & Odash. Cd 158
2.3. Çinko (Zn) Ağır Metali ve Bitkiler İçin Önemi
Çinko, Fe’den sonra canlı organizmalarda en fazla bulunan ikinci elementidir. Atom numarası 30, molekül ağırlığı 65,409 g/mol olan Zn’nun yeryüzündeki ortalama konsantrasyonu 70 mg/L’dir ve bitkilerin gelişimi için gerekli eser elementlerden biridir. Buna karşılık, çinko bileşiklerinin düşük zehirlilik etkisi olduğu da bilinmektedir (Kartal vd., 2004; Frassinetti vd., 2006; Broadley vd., 2012: 212-223).
300’den fazla enzimin yapısında bulunan Zn, bitkilerde karbonhidrat, protein, fosfat, DNA ve RNA sentezlerinde görev almaktadır (Frassinetti vd., 2006; Okçu vd., 2009). Ayrıca bitkide azot metabolizması, nişasta oluşumu ve tohum olgunlaşması, büyüme hormonlarının (oksin hormonu) üretilmesi, internodun uzaması ve sürgünlerin gelişimi için önemli bir mikro elementtir (Bolat ve Kara, 2017).
Zn, bitkilerde yaygın olarak noksanlığı görülen mikro besin elementlerinden biridir. Dünya genelinde tahıl yetiştirilen alanların yaklaşık yarısında, düşük toprak nemi, düşük organik madde ve yüksek pH gibi olumsuz fiziksel ve kimyasal faktörler nedeniyle çinkonun bitki kökleri vasıtasıyla alımının yetersiz olduğu bilinmektedir (Barut, 2017). Zn eksikliğinde bitkilerde görülen belirtiler; yapraklarda klorosis, yaprak alanında küçülme, internodlarda kısalma ve tomurcuk gelişiminde azalmadır (Broadley vd., 2012: 222).
Günümüzde sucul ortamlardaki Zn kirliliğin giderilmesinde remediasyon yöntemleri sıklıkla kullanılmaktadır. Liu vd. (2007) yaptıkları çalışmada 19 sulak alan bitkisi tarafından Cd, Pb ve Zn’nin akümülasyonunu incelemiş ve Zn’yi Alternanthera philoxeroides, Zizania latifolia, Echinochloa crus-galli, Polygonum hydropiper, Isachine globosa, Digitaria sanguinalis ve Fimbristylis miliacea bitkilerinin en iyi biriktirdiğini tespit etmişlerdir. Khan vd. (2008) yaptıkları çalışmada, Artemisia vulgaris, Stevia rebaudiana, Galium aparine, Mucuna pruriens ve Withania somnifera bitkilerinin yapraklarında biriktirdikleri Zn içeriğini araştırmış ve Artemisia vulgaris’te 38,14 mg/L, Stevia rebaudiana’da 47,18 mg/L, Galium aparine’te 45 mg/L, Mucuna pruriens’te 32,48 mg/L, Withania somnifera’da ise 43,01 mg/L Zn’yi yapraklarında biriktirdiğini ortaya koymuşlardır.
Ghaderian ve Ghotbi-Ravandi (2012)’nin İran'ın güneydoğusundaki Sarcheshmeh bakır madenciliği alanında yapmış oldukları çalışmada, bölgedeki toprak örneklerinin metal konsantrasyonlarının Cu:1 300, Zn: 1 500, Pb: 700 ve Ni: 35 μg/g olarak tespit etmişlerdir. Aynı
alanlardan toplanan bitki türlerinin yapraklarındaki ağır metal konsantrasyonlarının ise, Cu için 1-4 012 μg/g, Zn için 2-1 074 μg/g, Pb için 1-76 μg/g ve Ni için 0,1-22 μg/g arasında değiştiğini bulmuşlardır. Yapraklarında en yüksek oranda Cu içeren bitkilerin Polypogon fugax (4 012 μg/g), Epilobium hirsutum (1 581 μg/g) ve Onosma stenosifon (657 μg/g) olduğunu ve Cu metali ile kirlenmiş arazilerin temizlenmesinde Polypogon fugax ve Epilobium hirsutum bitkilerinin uygun hiperakümülatör bitkiler olduğunu ortaya koymuşlardır.
Karahasan ve Bayrak Özbucak (2015)’de yaptıkları çalışmada Ordu ili sınırları içerisinde bulunan Melet, Turnasuyu ve Akçaova sucul ekosistemlerinde yayılış gösteren Typha latifolia L. bitkisinin kök, gövde, rizom ve yaprak kısımlarında ağır metal (Cu, Zn, Fe, Cd, Pb, Mn) birikimi ve makro element (N, P, K, Ca, Mg, Na) miktarlarını belirlemişlerdir. Yaptıkları analizlere göre bitki kısımlarının içerdiği ağır metal ve makro element miktarlarını yüksek konsantrasyondan düşük konsantrasyona doğru sıralamış ve gövde için N > P > K > Na > Ca > Mg > Zn > Fe > Mn > Pb > Cd > Cu, kök için N > P > K > Ca > Mg > Fe > Na > Mn > Zn > Pb > Cd > Cu, yaprak için N > P > K > Ca > Mg > Na > Mn > Zn > Fe > Pb > Cd > Cu, ve rizom için N > P > K > Ca > Mg > Na > Fe > Zn > Mn > Pb > Cd > Cu olarak tespit etmişlerdir.
Jayasri ve Suthindhiran (2017)’daki çalışmasında Lemna minor bitkisini farklı konsantrasyonlarda Zn (0.5, 5, 10, 15, 20 mg/L) ve Pb (1, 2, 4, 6, 8 mg/L) içeren ortamlarda yetiştirmiş ve 4 gün boyunca Zn ve Pb metallerine maruz bırakılan L. minor’ün kuru ağırlık/taze ağırlık oranını, fotosentetik pigment üretimini, katalaz enzim aktivitesini ve protein içeriğini incelenmiştir. Buna göre, 10 mg Zn /L ve 4 mg Pb/L konsantrasyonlarının L. minör’ün tolerans gösterebildiği optimum konsantrasyonlar olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca 20 mg Zn/L ve 8 mg Pb/L metal konsantrasyonlarının proteinler üzerinde olumsuz etki gösterdiğini ve protein oranının Zn’de 13 kat azalırken Pb’de 4 kat azaldığını tesbit etmişlerdir. Ayrıca, aynı konsantrasyonlarda bitkinin fotosentetik pigmentlerinin ve yaprak sayısının da azaldığını bulmuşlardır.
Arán vd. (2017) çalışmasında, fitoremediasyon tekniğini kullanarak Pb, Cr, Ni ve Zn ağır metallerinin Limnobium leavigatum bitkisi tarafından alınımı ve bitkinin bu metallere karşı olan toleransını araştırmıştır. 3 farklı ağır metal konsantrasyonu içeren alandan alınan örneklerden, bitkinin köklerindeki Pb, Cr, Ni ve Zn birikim oranının yapraklardaki birikim oranına göre daha fazla olduğunu tespit etmişlerdir. BCF’nin (Biyokonsantrasyon faktörü) bitkinin köklerinde 11 500 ve yapraklarda 3 300 olduğunu bulmuşlardır.
Sricoth vd. (2018)’nın yapmış oldukları çalışmada, ağır metal ve organik kirleticiler ile kirlenmiş atık suların Typha angustifolia ve Eichhornia crassipes ile iyileştirilmesini araştırmışlardır. Atık su içerisinde yetiştirilen her iki türün de % 100 oranında hayatta kaldığı, T. angustifolia’nın kuru ağırlığı ve büyüme oranın yaklaşık 3,3 kat, E. crassipes’in ise 2,7 kat artmış olduğu gözlemlenmiştir. T. angustifolia ve E. crassipes bitkilerinin köklerinde sırasıyla Zn>Cd>Pb biriktirdiği tespit etmişlerdir.
Willscher vd. (2017)’de yaptıkları çalışmada topraktaki farklı pH ve ağır metal konsantrasyonları altında Helianthus tuberosus’un fitoekstraksiyon kapasitesini, büyüme davranışlarını ve ağır metal akümülasyonunu araştırmış ve bitkinin köklerinde pH 5’de 853 mg Zn/kg ve pH 6’de ise 665 mg Zn/kg biriktiğini tespit etmişlerdir.
3. DOKU KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI
Dünya üzerinde yaklaşık 350 000 bitki türü vardır. Bunlardan sadece 80 000 bitki türünün besin değeri olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, günümüzde sadece 150 kadar bitki türü insanlar için besin kaynağı olarak kullanılmaktadır. Üretimi yapılan bu bitkilerden buğday, mısır, pirinç ve patates günlük diyetimizin yarısını oluşturan bitkilerdir (Fuleky, 2009). Bitkilerin insanlar ve hayvanlar için besin maddesi olarak kullanılması amacı ile bitki ıslah çalışmalarında iki önemli dönem bulunmaktadır (Babaoğlu vd., 2002:1). Bunlardan ilki 1940-1980 yılları arasında dünya genelinde gözlenen tarımsal üretim artışını ifade eden “Yeşil Devrim”dir (Sonnenfeld, 1992; Hazell, 2009:1; Ziaei vd., 2015). Gelişmekte olan ülkelerde daha yoğun biçimde gözlenen bu değişim 1960'ların sonlarında hızlanmıştır (Hazell, 2009:1). İkinci dönem ise “Gen Devrimi” olarak bilinmektedir. DNA’nın tespiti ve ikili sarmal yapısının ortaya konulması, bitki doku kültüründe öğrenilen yeni bilgiler ve teknikler ile bu tekniklerin her bitkiye uygulanabilir olması gen devrimi döneminin başlamasını hızlandırmıştır (Babaoğlu vd., 2002:1).
Bitki doku kültürü; “steril ortam koşullarında, suni besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon ya da kallus hücreleri), doku (eksplant=bitkinin çeşitli kısımları) veya organ (apikal meristem, sürgü ucu, kök, gövde veya yaprak) parçalarının kullanılarak yeni bir doku, yeni bir bitki veya yeni bitkisel ürünlerin (metabolitler vb.) üretilmesi” işleminin genel adıdır (Gönülşen,1987:1; Babaoğlu vd., 2002:2; Kocaçalışkan, 2017:21). Doku kültürü teknikleri (in vitro teknikler) kullanılarak verim oranı yüksek olan bitkilerin hızlı üretimi, virüssüz sağlıklı bitki üretimi, sentetik tohum üretimi, genetik çeşitliliğin saklanması (soğuk saklama ve dondurarak saklama) (Sharma vd., 1996; Dinçer vd., 2016), yeni çeşitlerin oluşturulması, geliştirilmesi ve mevcut olan genetik çeşitlilikte farklı varyabilite elde edilmesi doku kültürünün amaçlarından sadece birkaçıdır. Bu sebeple genetik ıslah çalışmalarında doku kültürü yöntemlerinin rolü büyüktür (Babaoğlu vd., 2002:2).
Doku kültürü alanında ilk çalışmayı Alman botanikçi Haberlandt 1900’lü yılların başlarında yapmış ve bitkilerden aldığı doku parçalarını besi yeri adı verilen ortamlara aktararak bitki üretmiştir. Haberlandt’a göre totipotensi (toplam güç) teorisi, “Her bitkinin başlangıcı bir zigottur. Zigot ise tüm bitkinin toplam genetik potansiyelini muhafaza etmektedir. O halde bir bitkinin her canlı hücresinde o bitkinin toplam genetik potansiyeli vardır.” diyerek doku kültürünün önemini ortaya koymuştur. Bu teori ile doku kültüründe ürettiği bitkilerden izole ettiği hücreleri kültüre almış lakin ömrü bu aşamayı görmesi yetmemiştir (Kocaçalışkan, 2017:46). Haberlandt’ın ortaya koyduğu teorinin ispatı 1965 yılında Vasil ve Hilderbrant tarafından
yapılmıştır (Thorpe, 2007). 1970’li yıllarda yapılan çalışmalar sonucunda protoplasttan bitki geliştirilmesinin mümkün olduğu ortaya koyulmuştur (Evans vd., 1972; Kocaçalışkan, 2017:21). Bitki doku kültürüyle ilgili önemli çalışmaların tarihsel gelişimi kronolojik olarak Çizelge 3.1.’de verilmiştir.
Çizelge 3.1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar (Babaoğlu vd., 2002: 3).
Tarih Çalışmalar Araştırıcılar 1902 İlk izole hücrelerin kültürü Haberlandt. 1904 Olgun embriyoların kültürü Hanning. 1917 Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanımı Karl Ereky. 1920 Oksin hormonunun keşfi ve tanımlanması Went vd.
1922 Kök ve sürgün uçlarının tek başına laboratuvarda çoğaltımı Kotte ve Robbins. 1924 İlk embriyo kurtarma tekniği (mısır) Dieterich. 1934 İlk sürekli olarak tek başına çoğalan kök kültürleri (domates) White. 1934 İlk kallus (değişmeden bölünüp çoğalan hücre topluluğu) kültürleri Gautheret. 1942 İlk kallus kültürlerinden sekondermetabolit eldesi Gautheret. 1946 İlk sürgün uçlarından (apikal meristem) bitki eldesi Ball.
1953 DNA'nın yapısının belirlenmesi Watson ve Crick. 1954 İlk hücre süspansiyonlarından bitki eldesi Muir vd.
1957 İlk sitokinin hormonunun tanımlanması ve öneminin ortaya konulması Skoog ve Miller. 1958 İlk somatik embriyogenesis (havuç) Steward vd. 1960 Enzimler kullanılarak ilk canlı protoplastizolasyonu Cocking. 1962 Murashige ve Skoog (MS) doku kültürü besin ortamının geliştirilmesi Murashige ve
Skoog. 1965 Tek hücreden bitki elde etme (rejenerasyon) Vasil ve
Hilderbrandt. 1967 İlk haploid bitkinin üretimi (anter polen kültürü) Bourgin ve Nitsch. 1968 B5 ortamının geliştirilmesi Gamborg vd. 1970 HEPA filtrelerin kullanılmaya başlanması
1978 Cinsler arası ilk somatik melezleme Melchers vd.
1983-1986 Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi ve tarla testleri (tütün) Murai vd. 1990 Sentetik tohum geliştirme ve hızlı dondurma yoluyla germplazm muhafazası çalışmalarının başlaması
1995 İlk rekombinant (genetik olarak değiştirilmiş) insan gıdası (Flavr Savr, domates)
Bitki doku kültürü çalışmalarında ve genetik iyileştirmede kullanılan sistem, bitki rejenerasyonudur. Bitki rejenerasyonu için çeşitli doku kültürü yöntemleri geliştirilmiştir. Bitki doku kültürü yöntemlerini altı kısımda incelemek mümkündür. Bu yöntemleri embriyo kültürü, meristem kültürü, kallus kültürü, hücre kültürü, haploid kültürler ve protoplast kültürü olarak sıralayabiliriz (Gönülşen, 1987:25-28-33-43-55; Smith, 2013: 73-79, 103-109, 113-117, 119-124; Kocaçalışkan, 2017:45-48-64-68-81-92).
Klasik ıslah yöntemleri ile doku kültürü tekniklerini karşılaştırdığımızda, bitkinin sahip olduğu özelliklerin tuzluluk stresi, ağır metal toleransı, herbisitlere dayanıklılığı, sıcaklık ve hastalık gibi etmenlere karşı toleransının oluşması uzun zaman almaktadır. Yüksek iş gücü ve ağır maliyetli olması, klasik ıslah yöntemleri için bir dezavantaj olarak görülmektedir. Bununla birlikte klasik ıslah yöntemlerinde aralarında melezleme yapılabilen bitki türü sayısının düşük olduğu ve bu durumun başarıyı sınırladığı bilinmektedir. Biyoteknoloji ise bu sınırlılık faktörlerini ortadan kaldırabilecek bir teknoloji olarak tanımlanmaktadır. Klasik ıslahda yabani gen kaynaklarının aktarılmasında ortaya çıkan zorlukların giderilmesinde yararlanılan biyoteknolojik yöntemler, melezlenmesi mümkün olmayan bitki türlerinin melezlenmesine imkan tanımaktadır (Iliev vd., 2010; Haspolat, 2012; Suman, 2017).
Son yıllarda, dünyada önemi oldukça artan biyoteknolojik çalışmalara Türkiye’de yaklaşık 25 yıl önce başlanmıştır. Türkiye’de yapılan ilk çalışmalarda doku kültürü üzerine yoğunlaşılmış ancak sonrasında biyoteknoloji alanına yönelim olmuştur. Virüssüz meyva fideleri üretimi, ıslah süresinin kısaltılması, hastalık ve zararlılara karşı dayanıklı türler geliştirilmesi gibi konularda araştırmalar yapılmıştır. TÜBİTAK, üniversiteler ve önemli araştırma kuruluşları biraraya gelerek biyoteknoloji ile ilgili önemli kararlar almışlar ve bu süre zarfı içinde birçok üniversitede laboratuvarlar kurularak uygulamalı dersler verilmeye başlanmıştır (Babaoğlu vd, 2002: 32-33).
Ashrafzadeh ve Leung (2015) de yaptıkları bir çalışmada bitki biyoteknolojisini, in vitro koşullarda hücre ve doku kültürünü kullanarak soğuk stresi ve yüksek toprak tuzluluğu gibi farklı abiyotik streslere dirençli bitkilerin geliştirilmesinde pratik bir bitki yetiştirme yöntemi olduğunu belirtilmiştir. Yaptıkları çalışmada, ağır metal stresine dirençli bitkilerin gelişimi için uygulanan in vitro yetiştirme yöntemlerin uygulanması konusunu ele alınmıştır. In vitro bitki yetiştiriciliğinin temel esaslarını ve ağır metallere dirençli bitkilerin geliştirilmesi üzerine kat edilen ilerleme ana hatları ile özetlenmiştir.
Rogers (2003)’de yaptığı çalışmada, tatlı su ve sulak alanlarda baskın bir şekilde yayılış gösteren, yüksek biyokütle oluşturabilen ve farklı ekosistemlere toleranslı olan Typha sp., Juncus sp., Scirpus sp. ve Carex sp. cinslerine ait bazı bitki türlerini mikroçoğaltım yöntemi kullanarak üretimi yapılmıştır. Mikroçoğaltma yöntemi ile üretilen bu bitkilerden oluşan bir sulak alan kurulması amaçlanmıştır. T. latifolia, T. angustifolia ve J. accuminatus, karanlıkta pikloram uygulaması ile uyarılarak kallus oluşturulmuştur ve daha sonra sürgün oluşturmak için ışıklı ortamda BAP içeren besin ortamına aktarılmıştır. J. effusus, S. polyphyllus ve C. lurida kallusları
siyah renge döndüğü için bu bitkilerin kalluslarından fide elde edilememiştir. Bitkilerin çoğu az miktarda oksin içeren ya da hiç büyüme düzenleyici içermeyen besin ortamında köklendirilmiştir. Ancak J. effusus bitki türünü köklendirmek için besin ortamının içerisine kömür ilave edilerek köklenmesi teşvik edilmiştir. Daha sonra kültürden alınan fideler serada yetiştirilmeye devam edilmiş ve fidelerde herhangi bir anormallik gözlenmemiştir. Bu mikroçoğaltım yöntemleri uygulanarak elde edilen bitkiler habitatlardaki restorasyon çalışmalarında kullanılabileceğini ve sulak alan yapımında uygulanabilir bir yöntem olduğu ortaya konulmuştur.
Liu vd. (2004)’de yapmış oldukları çalışmada, nesli tehlike altında olan ve tıbbi özellik gösteren Hydrastis canadensis L. bitkisinin doğal ortamında yetişen bitkilerinde alüminyum (Al) (848 μg g-1), kadmiyum (Cd) (0.4 μg g-1), kurşun (Pb) (18.7 μg g-1) ve civa (Zn) (0.1 μg g-1) gibi
ağır metalleri içerdiği belirlenmiştir. Yaptıkları araştırmada 10 μM BAP içeren besin ortamında H. canadensis bitkisinin gövde segmentlerinden çok sayıda rejenerasyon meydana geldiği ve in vitro ortamda yetiştirilen bitkilerin daha düşük ağır metal konsantrasyonu içerdiği ortaya konulmuştur.
Dal Corso vd. (2005)’de yaptıkları çalışmada, Arabidopsis halleri L. bitkisinin kök eksplantlarından kallus indüksiyonu, somatik embriyoların indüksüyonu ve sürgün gelişimi olmak üzere 3 aşamalı bir yöntem uygulayarak bitki rejenere edilmiştir. Kök segmentleri, yaprakçıklar ve yaprak sapından eksplantlar alınmış ve 0,5 mg/L 2,4-Diklorofenoksiasetik Asit (2,4-D) ve 0,05 mg/L kinetin ile takviye edilmiş MS besin ortamına inkübasyona bırakılmıştır. Sadece kök segmentlerinden elde edilen kalluslar 2,0 mg/L 6-dimetilamino-pürin (2ip) ve 0,05 mg/L Naftelen asetik asit (NAA) içeren rejenerasyon ortamına aktarıldığında büyümenin devam ettiğini ve % 40 oranında embriyonik yapıların geliştiği gözlemlenmiştir. Aynı ortamda bu kallusların % 38’inin tekrar filizlediği görülmüştür. Hormonsuz MS besin ortamında kültüre alınan sürgünlerin % 50’si köklendirilmiştir.
Nehnevajova vd. (2007) yaptıkları çalışmada toksik metalleri biriktirme potansiyeline sahip olan Brassica juncea bitkisinin akümülasyon potansiyelini arttırmak için in vitro yetiştirme teknikleri kullanılmıştır. B. juncea tohumları MS besin ortamında 6 gün boyunca çimlendirilmiştir. Çimlenen B. juncea’nın yapraklarından ve hipokotillerinden örnekler alınmıştır.10 μM Cd ve 200 μM Pb içeren modifiye edilmiş MS besin ortamına eksplantlar ve hipokotilleri aktarılmış ve kallus elde edilmiştir. Yenilenmiş metal toleranslı B. juncea fideleri Cd, Zn ve Pb uygulanan hidroponik ortama aktarılmıştır. Hidroponik ortamdaki 30 bitkide 3 tip fenotip gözlemlenmiştir. Toplamda 30 adet bitkinin 7 tanesi kontrol grubu olmakla birlikte geriye
kalan bitkilerde anlamlı ölçüde ve yüksek miktarda metal birikiminin olduğu tespit edilmiştir. B. juncea’nın fitoremediasyon çalışmalarında kullanılabileceği ortaya konulmuştur.
Gatti (2008)’de yaptığı çalışmada ağır metallerle kirlenmiş alanlarda hızlı büyüyen ve kontaminasyona dirençli bir tür olan Ailanthus altissima bitkisi kullanılmıştır. A. altissima bitkisi için bir mikro çoğaltma protokolü geliştirilmiş ve buna göre sürgünler in vitro ağır metal toleransı için test edilmiştir. Buna göre 1,32 ya da 2,64 μM BAP içeren MS besin ortamında en iyi çoğaltım oranı elde etmişlerdir. Ağır metallere maruz bırakılan A. altissima bitkisinin, fitoremediasyonda kullanılan türlerle karşılaştırılabilir bir tolerans sergilediği tespit edilmiştir.
Türker vd. (2009) yapmış oldukları çalışmada in vitro ortamda kültüre alınan Lythrum salicaria bitkisinin yaprak ve gövde eksplantlarını kullanarak sürgün rejenerasyonu sağlanmıştır. Yaprak eksplantlarının rejenerasyon oranının gövde eksplantına göre daha yüksek olduğu belirtilmiştir. Ayrıca, test edilen hormon konsantrasyonlarından Thidiazuron (TDZ) (0,1-0,3 ve 0,5 mg dm-3) içeren besin ortamlarının diğer hormon kombinasyonlarına göre sürgün
rejenerasyonu üzerine daha etkili olduğunu ortaya koyulmuştur. Sürgün başına düşen kök sayısı ve kök oluşturan sürgünlerin sıklığı açısından kök oluşturma potansiyeli en yüksek olan oksin hormonunun Indole-3-Asetik Asit (IAA) olduğu tespit edilmiştir. Köklendirilen rejeneratifler 4 hafta boyunca hava nemi azaltılmış ortamda bırakıldıktan sonra % 90’dan fazlasının hayatta kaldığını gözlemlenmiştir.
Doran (2009) tarafından in vitro olarak yetiştirilen bitki hücresi ve organ kültürlerinin fitoremediasyon çalışmalarında kullanımı üzerine faydaları ve sınırlamalarını ortaya koyan bir çalışma yapılmıştır. Buna göre, doku kültüründe kullanılan hücre süspansiyonları ile kallus ve saçak kök oluşturma gibi uygulamaların fitoremediasyon çalışmalarında sıkça kullanıldığını belirtilmiştir. Doku kültürü yöntemleri ile elde edilen bu sonuçların, geleneksel bitki üretim yöntemine göre maliyeti azaltacağı öne sürülmüştür.
Hasançebi vd. (2011) tarafından, Türkiye’ye endemik bir bitki türü olan Astragalus chrysochlorus Boiss. & Kotschy bitkisi için mikroçoğaltım ve kök kültür protokolü geliştirilmiştir. 0,5 mg/L trans-Zeatinriboside (ZR) içeren MS besin ortamında en yüksek gövde oluşturma frekansı (% 100) elde edilmiş olup, bu ortamda ise gövde sayısının (gövde/hipokotil eksplant) 13 adet olduğu tespit edilmiştir. Geliştirilen gövdecikleri % 2 sükroz içeren MS besin ortamına aktarılmış ve % 93 oranında kök gelişimi gözlemlenmiştir. In direkt organogenezde ise, MS besin ortamına 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) eklenerek hipokotil eksplantlarından
yüksek oranda kallus elde edilmiştir. Elde edilen kalluslar 0,5 mg/L ZR’li MS besin ortamına aktarılmış ve bitki rejenerasyonu gerçekleşmiştir. Yetiştirilen bitkiciklerin kök oluşumu 0,5 mg/L Naftalen Asetik Asit (NAA) içeren sıvı besin ortamında sağlanmıştır. Bu yöntem ve tekniklerin Astragalus L. türlerinin vejetatif çoğaltımına, sekonder metabolit üretimine ve hücre-kök kültürlerinin kullanımına olanak sağlayacağı belirtilmiştir.
Dreger vd. (2016) tarafından, steroidler, triterpenoidler ve yağ asitlerince zengin, ürogenital hastalıkların tedavisinde kullanılan ve Onagraceae familyasına ait Chamaenerion angustifolium ve Epilobium angustifolium tıbbi bitkileri kullanılmıştır. Steril fideler Türker vd. (2009)’da tanımlanan modifiye edilmiş MS besin ortamlarına aktarılmıştır ve değişkenler arasındaki farkların önemi istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Eksplant başına 16–20 adet sürgün, toplamda 3 000’den fazla bitki üretilmiştir. Üretilen bitkilerden elde edilen hammaddenin gıda ve ilaç endüstrisi için kullanılabilirliği üzerine çalışma yapılmıştır. Son yıllarda dünyada, fitoremediasyon çalışmalarında kullanılan hiperakümülatör bitkilerin çoğaltılması ve bu bitkilerin kirleticileri bünyelerinde biriktirebilme yeteneklerinin geliştirilmesine yönelik bitki doku kültürü çalışmaları hız kazanmıştır (Doran, 2009; Sarma, 2011; Ashrafzadeh ve Leung, 2015). Bu çalışmanın amacı, sulak alanlarda yayılış gösteren Epilobium hirsutum L. bitkisinin, çinkonun fitoremediasyonunda kullanılabilirliliğini ortaya koymak ve bitkinin doku kültürü yöntemleri ile çoğaltımını sağlayarak su kültürüne adaptasyonunu gerçekleştirmektir.
4. MATERYAL ve METOT
4.1. Epilobium hirsutum L. Fitoremediasyon Deneyleri
Bu çalışmanın ana materyali olan Epilobium hirsutum L. (Onagraceae), çok yıllık tıbbi bir bitki olup halk arasında tüylü yakı otu olarak bilinmektedir (Şekil 4.1.). Bitkinin bağlı olduğu Onagraceae familyası ülkemizde 4 cins ve 31 tür ile temsil edilmektedir. Bu cinslerden biri olan Epilobium L. (1753) cinsinin 21 türü bulunmaktadır. E. hirsutum çok yıllık, çok dallı ve kalın rizomlu, gövdesi 30-210 cm, yoğun tüylü bir bitkidir. Yaprakları lanseolattan oblanga doğru 2-12 cm uzunluğunda ve 0,8-2,5 cm genişliğinde, sık tüylü, serrat ve sesildir. Çiçekleri pembemsi mor, glandular veya glandular olmayan tüylüdür. Petaller 8–20 mm, stigma derin ve 4 loblu. Kapsül 4-10 cm, tohumlar obovoid, 1-15 mm ve papillalıdır (Davis, 1972). Bitki dünya üzerinde İsveç, Danimarka’nın kuzey bölgeleri, Finlandiya, Kuzey Baltık Denizi, Rusya, Norveç, Asya, Japonya ve Himalayalar’dan Pakistan sınırına kadar olan bölgelerde geniş yayılış göstermektedir (Abeş, 2007). Davis (1972)’e göre bitki ülkemizde Tekirdağ, İstanbul, Kars, Bolu, Kastamonu, Samsun, Trabzon, Gümüşhane, Bayburt, İzmir, Kütahya, Afyon, Ankara, Tunceli, Erzurum, Bitlis, Antalya, Konya, Niğde, Hatay, Urfa, Siirt ve Hakkâri illerinde yayılış göstermektedir.
Ülkemizde doğal yayılış gösteren bitki, birçok ülkede istilacı tür olarak tanımlanmıştır. Kuzey İrlanda ve Amerika’da yapılan araştırmalar, Epilobium cinsinin birçok türünün istilacı özelliğe sahip olduğunu göstermiştir. Amerika’ya 1800’lü yılların başında park ve bahçelerde peyzaj amaçlı kullanılmak üzere ekimi yapılmış ve bitki zaman içerisinde istilacı özellik gösterip doğal bitki örtüsüne zarar vermeye başlamıştır. Bu özelliğinden dolayı, bitki Pennsylvania Üniversitesi Doğal Kaynaklar Koruma Bölümü, ISI Doğa Koruma Topluluğu ve Washington State Üniversitesi Ekoloji Bölümü tarafından tehlikeli ve istilacı bitkiler listesine alınmıştır
(
Gençler
Abeş, 2007).4.1.1. E. hirsutum tohumlarının toplanması
2016 yılı Eylül-Ekim aylarında Kütahya il sınırları içinde bulunan Porsuk Nehri kenarına periyodik ziyaretler yapılmış, bitki örnekleri ve bitkiye ait kapsüller toplanmıştır. Bitki örneklerinin Davis (1972) “Flora of Turkey and East Aegean Islands” göre teşhisi yapılmıştır. Toplanan E. hirsutum kapsülleri oda sıcaklığında kurutulmuş ve kuruyan kapsüllerin içinden tohumlar ayıklanarak (Şekil 4.2.), cam kavanozlara alınıp nem ve ışık almayacak şekilde laboratuvarda muhafaza edilmiştir
Şekil 4.2. Epilobium hirsutum kapsülünün genel görünüşü.
4.1.2. E. hirsutum tohumlarının çimlendirilmesi ve yetiştirilmesi
Ayıklanan tohumlar binoküler mikroskopta incelenmiş ve morfolojik olarak düzgün ve olgun tohumlar deneylerde kullanılmak üzere seçilmiştir (Şekil 4.3.). İlk olarak, E. hirsutum
fidelerinin yetiştirileceği % 10’luk Hoagland çözeltisi hazırlanmıştır (Hoagland ve Arnon, 1950; Kocaçalışkan, 2008: 268). Farklı konsantrasyonlarda Zn içeren %10’luk Hoagland çözeltisi hazırlamak için ZnSO4.7H2O kullanılmıştır.
Şekil 4.3. E. hirsutum tohumunun genel görünüşü.
Fitoremediasyon deneylerinde kullanılacak olan fidelerin eldesi için tohumlar içerisinde torf toprağı bulunan viyollere, viyol başına 15-20 adet olmak üzere ekilmiştir. Ekilen tohumlar damlalık yardımı ile %10’luk Hoagland çözeltisi ile sulanmış ve viyoller, içinde % 10’luk Hoagland solüsyonu içeren küveytlerin içine konularak nem kaybını önlemek için üzerleri streç film ile kapatılmıştır. Viyoller 25 0C ve 6 000 lüxışık şiddetine sahip su kültürü odasına alınmıştır.
Çimlenme sonrasında E. hirsutum tohumlarının üzerindeki streç çıkartılmış ve 8-10 yaprak sayısına ulaşana kadar bu ortamda yetiştirilmiştir (Şekil 4.4.).
Şekil 4.4. Viyoller içerindeki 8-10 yapraklı E. hirsutum fideleri.
4.1.3. E. hirsutum fidelerinin hidroponik ortama adaptasyonu
8-10 yaprak sayısına ulaşan E. hirsutum fideleri viyollerin içinden çıkarılmış, kökleri distile su ile yıkanmış, içerisinde %10’luk Hoagland çözeltisi bulunan 2,5 lt’lik su kültürü saksılarına transfer edilmiş ve 7 gün boyunca adaptasyona bırakılmıştır. Su kültürüne alınan E. hirsutum fide köklerinin oksijen ihtiyacı hava motoruna bağlanmış plastik borular yardımı ile giderilmiştir (Şekil 4.5.). Adaptasyon süresince günlük olarak saksılardaki çözelti seviyesi kontrol edilmiş ve çözelti seviyesi azalan saksılara %10’luk Hoagland çözeltisi ilave edilmiştir.
4.1.4. Fitoremediasyon deneyleri
1 haftalık adaptasyon sonunda, bitkinin ölmeden sağlıklı olarak gelişebileceği Zn konsantrasyonlarını belirlemek için, fideler 0 (kontrol), 50, 100, 150, 200 mg/L Zn içeren % 10’luk Hoagland çözeltilerine alınmış ve 7 gün süre ile bu çözeltilerde yetiştirilmiştir. 7 günün sonunda 100, 150 ve 200 mg/L Zn içeren çözeltilerde yetiştirilen E. hirsutum fideleri öldüğü için, fitoremediasyon çalışmalarında 0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 75 mg/L Zn içeren çözeltiler kullanılmıştır.
Deneylerin ikinci aşamasında, bitkinin en iyi gelişim gösterdiği ve en fazla Zn akümüle ettiği Zn konsantrasyonu belirlenmiştir. Bunun için, yukarıda verdiğimiz prosedür takip edilerek 1 haftalık adaptasyon aşamasından sonra elde edilen E. hirsutum fidelerinin, kök uzunlukları (cm), gövde uzunlukları (cm), yaprak sayıları ve yaş ağırlıkları (g) ölçülmüş ve veriler ilk ölçümler olarak not edilmiştir. Ölçümleri kaydedilen fideler, içerisinde 0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 75 mg/L Zn bulunan 2,5 lt’lik su kültürü saksılarına aktarılmıştır. Her saksıya 5’er adet fide konulmuş ve çalışmalar 3 tekerrürlü olarak gerçekleştirilmiştir.
Deneylerin üçüncü aşamasında, bitkinin en iyi geliştiği ve en fazla Zn akümüle ettiği 30 mg Zn/L içeren % 10’luk Hoagland çözeltilerinin pH’sı KOH ve HCl kullanılarak 4, 5, 6, 7 ve 8’e ayarlanmıştır. pH=8’de çözeltide Zn+2 çökelmesi görüldüğünden, çalışmada pH 8 ve üzeri
çözeltiler kullanılamamıştır. Yukarıda verdiğimiz prosedür takip edilerek E. hirsutum fideleri 30 mg Zn/L içeren ve pH’sı 4, 5, 6 ve 7 olan çözeltilere transfer edilmiş ve 7 gün süre ile bu çözeltilerde yetiştirilmiştir.
Tüm deneyler sonunda, E. hirsutum fideleri su kültüründen çıkartılmış ve kökleri %1’lik Na EDTA ile yıkanarak kurutma kâğıdı ile kurulanmıştır. Fidelerin kök uzunlukları, gövde uzunlukları, yaprak sayıları ve yaş ağırlıkları ölçülmüş ve veriler son ölçümler olarak not edilmiştir. Daha sonra fideler kök, gövde ve yapraklarına ayrılmış ve yağlı kağıttan hazırlanan paketler içerisine konulmuştur (Şekil 4.6.). Örnekler 70oC etüvde 48 sa. kurutulmuştur. Daha
sonra kuru örnekler RETCH marka havanda öğütülmüş ve ağır metal analizleri yapılana kadar cam kavanozlarda laboratuvarda muhafaza edilmiştir.
Şekil 4.6. Kurutma işlemi için hazırlanan E. hirsutum örnekleri.
4.1.5. Ağır metal analizleri
Ağır metal analizleri için öğütülmüş E. hirsutum örneklerinden 0,1’er gram tartılıp yakma tüplerine transfer edilmiştir. Yakma tüplerindeki E. hirsutum örneklerinin üzerine 5’er ml HNO3
ilave edilip, 1 gece boyunca çeker ocak içerisinde bekletilmiştir. Yakma işlemi 125 oC de FOSS
Digestor 2006 markalı yakma cihazında yapılmıştır (Şekil 4.7.). Örnekler tamamen yanana kadar yakma işleminde şu sıra takip edilmiştir (Kacar ve İnal 2008: 150-152) Bir gece boyunca % 10 HNO3 de bekletilen örnekler 1 sa. boyunca 125 oC’de yakılmıştır. 1 sa. yanan örnekler soğumaya
bırakılmış ve soğuyan her tüpün üzerine 3’er ml % 30’luk H2O2 (hidrojen peroksit) eklenerek
yakma işlemine devam edilmiştir. Tamamen yanan örnekler soğumaya bırakılmış ve soğuyan örneklerin son hacmi %10’luk HNO3 ile 100 ml’ye tamamlanmıştır. Zn analizi için yakılan
örneklerin analizi DPÜ İLTEM Araştırma Laboratuvarında bulunan AnalytikJena ContrAA 300 AAS marka Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi cihazı ile yapılmıştır. Analiz sonuçlarına göre bitkinin akümüle ettiği Zn miktarı mg/kg cinsinden hesaplanmıştır.
Şekil 4.7. Örneklerin yakılması.
4.2. Epilobium hirsutum L. Doku Kültürü Deneyleri
4.2.1. Besin ortamları, hazırlanışı ve sterilizasyonu
Doku kültürü deneylerinde, Murashige ve Skoog 1962 (MS) besin ortamı esas alınmış ve bu besin ortamı çeşitli büyüme düzenleyicileri ile birlikte çimlenme, rejenerasyon ve köklenme deneylerinde kullanılmıştır (Çizelge 4.1.).
Deneylerde kullanılan magenda kapları, cam kavanoz, pens, bisturi sapı, kağıt peçete gibi malzemeler 121 oC’de ve 1,1 atm basınç altında 20 dakika otoklavlanarak steril edilmiştir. 1 litre
MS besin ortamı için 4,33 g/L MS Basal salt, 0,103 g/L MS vitamin ve 30 g/L sükroz tartılarak 1 L ultra saf suda çözdürülmüştür. Hazırlanan solüsyonun pH’sı 1 M HCl ya da 1 M NaOH’ten ilave edilerek 5,7 ile 5,8 arasına ayarlanmıştır. Bu besin ortamına 7 g/L agar eklenerek ortam tamamen çözünene kadar ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda karıştırılmıştır ve kültür kaplarına dökülmüştür. Daha sonra buzdolabı poşetlerine koyulup üzerlerine otoklav bandı yapıştırılan besin ortamları 121 oC’de ve 1,1 atm basınç altında 20 dakika süresince otoklavda sterilize
edilmiştir. Yüksek sıcaklıkta yapısı bozulan bazı hormonların sterilizasyonu (Giberellik asit GA3
vb.) milipor filtre yardımıyla yapıldıktan sonra otoklavdan çıkarılan besin ortamına ilave edilmiştir.
Çizelge 4.1. Murashige ve Skoog (MS) besin ortamı (mg/L) (Murashige ve Skoog 1962).
İnorganik maddeler MS(mg/L)
Amonyum nitrat NH4NO3 1650
Kalsiyum klorür CaCl2.2H2O 440
Magnezyum sülfat MgSO4.7H2O 370
Potasyum dihidrojen fosfat KH2PO4 170
Potasyum nitrat KNO3 1900
Borik asit H3BO3 6,2
Kobalt klorür CoCl2.6H2O 0,025
Bakır sülfat CuSO4.5H2O 0,025
Mangan sülfat MnSO4.4H2O 22,3
Potasyum iyodür KI 0,83
Sodyum molibdat Na2MoO4.2H2O 0,25
Çinko sülfat ZnSO4.4H2O 8,6
Sodyum EDTA Na2EDTA 37,3
Demir sülfat FeSO4.7H2O 27,8
Organik maddeler Glisin 2,0 Myo-inositol 100 Nikotinik asit 0,5 Piridoksin.HCl 0,5 Thiamin. HCl 0,1 Sükroz 30 g/l
In vitro çalışmaların hepsi steril kabin içerisinde yapılmıştır. Çalışmaya başlamadan hemen önce steril kabinin tüm iç yüzeyi % 70’lik etanol ile temizlenmiştir. Steril kabin içerisinde bulunan Ultra Viyole (UV) ışın lambası her çalışma öncesinde 30 dakika açık tutularak kabin içi sterilize edilmiştir (Şekil 4.8.).
