EPG’ye Sahip İşletmecilere Getirilecek Yükümlülükler

A técnica de hard-docking posicionou os ligantes (IPs) nas enzimas e a partir do arquivo gerado com esses complexos a docagem automática foi realizada (figura 10).

(A)

(B)

Figura 10 - Complexo SfChy5 e IP controle. (A) Em azul, a quimotripsina está ligada ao IP controle (em verde) mostrando a posição de encaixe proteína-ligante. (B) A tríade catalítica da quimotripsina é mostrada no mesmo complexo

4.4.2 Conservação das estruturas

No alinhamento das estruturas das quimotripsinas foi possível observar que, apesar da alta conservação da maior parte das estruturas, existem diferenças na conformação de alças (loops) (figura 7). A região do sítio catalítico por sua vez permanece altamente conservada como era esperado, podendo ser também

observada no alinhamento das sequências primárias de aminoácidos (figura 11) e no alinhamento das estruturas (figura 12).

Figura 11 - Alinhamento das sequências primárias de aminoácidos das quimotripsinas. As sequências apresentam alta conservação estando os aminoácidos que formam a tríade catalítica marcados com seta vermelha

10 20 30 40 50 60 70 80

. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | SFCHY2 IVGGSVTDISNVPYQAGLVIQVL-VIFQSVCGGSIISHNRIVTAAHCN---WDGSITANSFTVVLGSNFLFSDGNRITTR

SFCHY3 IVGGQASSLGQFPYQAGLLADFS--LGQGVCGGSLVRANRVLTAAHCW---FDGQNQAWRFTVVLGSIRLFTGGTRVQTT SFCHY4 IVGGAPAQLGQFPYQAGLIIILP--FWSSACGGSLLNTRKVITAAHCW---FDGQSQAISFTVVLGSINLYSGGTRVSSS SFCHY5 IVGGVPAGQGQYPYQAGLLISIIGFDGSGVCGGSLISAARVVTAAHCW---FDGMHQAWRVTVVLGSTTLFTGGTRIETS SFCHY7 IVGGSPSSAGQFPYQAGLLASYAGISGTGVCGGSLISANRVVTAAHCW---FDGINQAWLFNVVLGSTTLFSGGTRIQTS SFCHY9 IVGGSLASLGQFPYQAGLLLNYP--TRTGYASASLISHNRILTAAHNI---NDGFSNVPTVTVVLGTTTIMTGGVRQTTG SFCHY11 IVGGQASSLGQFPYQAGLLADFS--AGQGVCGGSLVRANRVLTAAHCW---FDGQNQAWRFTVVLGSIRLFSGGTRVQTS SFCHY12 IVGGQASSLGQFPYQAGLLADFS--AGQGVCGGSLVRANRVLTAAHCW---FDGQNQAWRFTVVLGSIRLFSGGTRVQTS SFCHY13 IVGGTQAATGSHPHMVALSSGVL--VRSFLCGGSLITQRTVLTAAHCIAAVFSGNSLTSSLRATVGTNRWNSGGTSYTLS

90 100 110 120 130 140 150 160

. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | SFCHY2 DVVMHPNWTPTTAANDIAVLRISS-VTFTNVIQPIALPSGNELNNDFVNWNAIASGYGLTADGAN--IGTTQRVSSVVLP

SFCHY3 NVVMHGSWTPNLIRNDVAVIKLSSNVALSDTIAVIALPSGSQLNENFAGENAVASGFGRTVDGAG--ITVNQFLSHVTLP

SFCHY4 NVVMHPNWTPSLVRNDVAMITLPNAVSTSNNLSPIALPSGNELNNNFAGFTGTASGFGYTRDGGS----VSPTLNHVDLP

SFCHY5 VMAMHPDWSPALIRNDVGVLYLPQAVQLSANIQPIAIATG---SSDFVGVSAIASGYGLTSSEGS--ISANQVLSHVRLN SFCHY7 AVMVHPNWVPVLVRNDVAVIYLPTPVPFSDTIKPIALPSGDQLNNDFVGATAIASGFGLTNDGGS--ISTNQFLSHVSLN SFCHY9 NYVIHENYDISIVRSDIAIINLPSSVQFSNILAPIALPSGSQLGENFVGQVAIASGYGFNPGIGG--MLANQPFSFVDLP

SFCHY11 NVVMHGSWNPSNIRNDVAMIRLNSNVGLSNTIALIALPSGSQLNENFAGENAVASGFGRTSDGAGGAITTNQFLSHVTLP

SFCHY12 NVVMHGSWNPSNIRNDVAMIRLNSNVGLSNTIALIALPSGSQLNENFAGENAVASGFGRTSDGAGGGITTNQFLSHVTLP

SFCHY13 RNVTHPNYVAATIKNDIGVLITSSNVALNNLVQVVPITYN----FIGQGVLSRVAGWGRIRSGGS----LSATLLELTLN

170 180 190 200 210 220 230 240

. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | SFCHY2 VISNAQCATVFGPWVHNSNICTSGAGGKGTCSGDSGGPLAVDSNNRRVLIGVTSYGAAAGCQIGLPAAFARTTSYVSWLQ SFCHY3 VITNIACRASFPLIVQDSNICTSGAGGRSTCQGDSGGPLVVTRNNSPLLIGVTSFGSARGCQVGSPAAFARVTSFISWIN SFCHY4 VITNAVCSNSLFWYVQDSNVCTSGAGGRSVCHGDSGGPLVVTSNNRRILIGVTSFGHWDGCQSGNPAAFARVTSFISWIN SFCHY5 VIANSACSYAFPLVVQPSN-LTSGIGGVGTCSGDSGGPLVASQNGQDVLICISSFGSAFGCQITCHQSSP-CTSLVVLSQ SFCHY7 VISNSVCSYAFPLILHSTNVCTSGLGGSSTCNGDSGGPLAVTINNEPVLIGVTSFGSALGCEASLPAAFARVTSYVDFFN SFCHY9 IITNNQCAGTYGSFIYNGIICTGSVPGKNICSGDSGGPLAINRNGNYILIGVVSFGRG-GCEGNSPSGYARVTHYINWIN SFCHY11 VITNAVCRSSFPLIIQDSNICTSGAGGRSTCQGDSGGPLVVTRSGRPLLIGITSFGSARGCQVGSPAAFARVTSFMSWIN SFCHY12 VITNAVCRSSFPLIVQDSNICTSGAGGRSTCQGDSGGPLVVTRSGRPLLIGVTSFGSARGCQVGSPAAFARVTSFMSWIN SFCHY13 TIDR--- 250 . . . . | . . . . | SFCHY2 ---SQ-- SFCHY3 ---SQL- SFCHY4 ---QNL- SFCHY5 PIFSVLQQLP SFCHY7 ---QHL- SFCHY9 ---QRL- SFCHY11 ---GQL- SFCHY12 ---GQL- SFCHY13 ---

Figura 12 - Conservação do sítio catalítico. Alinhamento estrutural das quimotripsinas mostrando a conservação da posição do sítio catalítico

Três quimotripsinas se destacaram por possuírem bem próximo ao sítio catalítico uma segunda serina (figura 13). Pelos cálculos de área, esse aminoácido parece também estar envolvido com a atividade catalítica dessas enzimas, pois além da proximidade com o sítio ativo, essa serina também perde grande parte de sua área quando essas enzimas estão em complexo com os IPs testados (exceto na SfChy9 – serina extra não está presente na IFR) (tabela 4).

SfChy2 SfChy5 SfChy9 (A) (B)

Figura 13 - Presença de uma serina extra. (A) Sequência primária das quimotripsinas SfChy2, SfChy5 e SfChy9 apresentando uma segunda serina (em rosa). (B) Na modelagem estrutural dessa enzimas é possível observar que a serina extra está na região do sítio catalítico

Tabela 4 - Cálculos de ASA. Cálculos para os aminoacidos que compõem a tríade catalítica das quimotripsinas e para a serina extra presentes na IFR

SfChy2 SfChy5

Posição na cadeia

ACCi ACCc ACCc-ACCi Posição

na cadeia

ACCi ACCc ACCc-ACCi

His 45 74.174 10.345 63.829 46 75.662 9.665 65.997

Asp 92 2.231 2.231 0.000 93 36.669 36.669 0.000

Ser extra 185 81.436 7.415 74.021 183 72.846 35.742 37.104

Ser 188 10.447 5.926 4.521 186 41.780 28.519 13.261

4.4.3 Afinidade das quimotripsinas ao IPs testados

A afinidade de uma enzima por um substrato ou IP pode ser inferida através do cálculo de energia livre do sistema quando essas moléculas se encontram complexadas. Através da análise dos modelos propostos, o programa AutoDock gerou 250 posições diferentes para cada complexo e realizou 250.000 cálculos de energia para que então fosse possível selecionar a energia livre do sistema de cada complexo.

Considerando todos os IPs testados, as quimotripsinas SfChy4, SfChy5 e SfChy7 foram as enzimas que apresentaram maior afinidade (menor valor de energia livre) aos IPs (tabela 5).

Tabela 5 - Valores de energia livre da ligação dos complexos modelados

1D6R 1G9I 1TAB 2CMY 2G81 2ILN 2QN5 2UUY Média

SfChy2 _-6.76 -6.59 -3.33 -6.85 -7.36 -6.17 -5.82 -7.5 -6.12571 SfChy3 -6.81 -6.31 -6.55 -5.61 -6.15 -3.3 -1.1 -8.44 -5.11857 SfChy4 -6.38 -8.28 -7.52 -8.9 -6.09 -7.16 -4.5 -9.6 -6.97571 SfChy5 -7.5 -9.96 -8.1 -9.5 -6.84 -5.35 -6.33 -10.18 -7.65429 SfChy7 -9.56 -9.88 -10.23 -11 -8.21 -5.24 -6.04 -9.04 -8.59429 SfChy9 -6.36 -6.78 -4.24 -9.73 - -4.62 -5.49 -8.9 -6.20333 SfChy11 -6.24 -8.64 -5.35 - -3.77 -3.46 -3.46 -8.36 -5.15333 SfChy12 -8.96 - -5.36 -7.66 -3.43 -4.43 -3.14 -7.6 -5.49667

Em uma análise de formação de clusters é possível perceber que dois grupos são formados de acordo com a afinidade inferida pelos valores de energia livre (figura 14). As quimotripsinas SfChy4, SfChy5 e SfChy7 formam um cluster separado de todas as outras enzimas.

Figura 14 - Gráfico de afinidade das quimotripsinas a todos os IPs testados. Quanto mais próximo de 1, menor é a afinidade da enzima pelo inibidor