Elektroforez ve Zimografi

3.3.10.1. Amilazın molekül ağırlığının belirlenmesi

SaflaĢtırma boyunca elde edilen fraksiyonların saflığını ve enzimin moleküler ağırlığı Laemmli yöntemine (1970) göre PAGE (poliakrilamit jel elektroforezi) ve SDS–PAGE (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi) ile tayin edildi. Standart olarak domuz miyozini (200.000 Da), E. coli‘den β-galaktozidaz (116.000 Da), tavĢan kasından fosforilaz B (97.400 Da), sığır albumini (66.000 Da), yumurta albumini (45.000 Da) ve sığır eritrositinden karbonik anhidraz (29.000 Da) kullanıldı. Enzimin görüntülenmesi için PAGE ve SDS–PAGE kullanılarak zimografi (Martinez vd., 2000) yapıldı. SDS-PAGE ve PAGE zimografi elektroforezi, aĢağıda anlatıldığı gibi gibi gerçekleĢtirildi.

3.3.10.2. PAGE ve SDS-PAGE için gerekli Çözeltiler

Yüzde 30’luk akrilamid/N,N'-metilenbisakrilamid stok çözeltisi: 30 g akrilamid ve 0.8 g N,N'-metilenbisakrilamid 100 mL deiyonize suda çözüldü. Hazırlanan çözelti koyu renkli ĢiĢede ve 4 °C‘ de saklandı.

Ayırma tamponu (separating tamponu): 1.5 M Tris-HCl hazırlandıktan sonra, HCl kullanılarak pH‘ı 8.8‘e ayarlandı ve oda sıcaklığında saklandı.

YoğunlaĢtırma tamponu (Stacking tamponu): 0.5 M Tris-HCl hazırlandıktan sonra pH‘ı 6.8‘e HCl ile ayarlandı ve oda sıcaklığında saklandı.

Amonyum persülfat: %10‘luk amonyum persülfat ultra saf su içerisinde taze olarak hazırlandı.

Sodyum dodesil sülfat (SDS): %10‘luk SDS ultra saf su içerisinde yavaĢ yavaĢ karıĢtırılarak hazırlandı.

Örnek tamponu: 0.6 M Tris-baz (pH 6.8) 5 mL, SDS 0.5 g, sukroz 5.0 g, β-merkaptoetanol‘den 0.25 mL ve %0.5‘lik stok brom fenol mavisi çözeltisinden 5 mL alınarak karıĢtırıldı ve hacmi ultra saf su ile 50 mL‘ye tamamlandı. PAGE için hazırlanan yükleme tamponunda SDS ve β-merkaptoetanol kullanılmadı. Örnek tamponu kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında saklandı. β-merkaptoetanol‘ün etkisi zamanla kaybolduğundan gerektiği zaman hazırlanan tampona aynı oranda ilave edildi.

Elektroforez tamponu (Yürütme tamponu): 3 g Tris-baz ve 14.4 g glisin ve 1 g SDS karıĢtırılarak hacmi ultra saf su ile 1 L‘ye tamamlanarak pH‘ı 8.3‘e ayarlandı. PAGE için hazırlanan elektrot tamponunda SDS kullanıldı. Hazırlanan tampon kullanılıncaya kadar 4 C‘de saklandı. Tampon 2-3 kez kullanıldıktan sonra yenilendi.

Coomassie Blue G-250 Çözeltisi: Commasie blue boyadan 100 mg, önce 200 mL metanol (%50) içinde çözüldü, daha sonra 35 mL asetik asit (%10) ilave edilerek, ultra saf su ile 500 mL‘ye tamamlandı.

%2’lik çözünür niĢasta çözeltisi: Çözünür patates niĢastasından 2 g tartıldı ve deiyonize distile su içerisinde mikrodalga fırında tamamen çözününceye kadar ısıtıldı. Soğudukan sonra 0.45 μm‘lik enjektör filresinden geçirildi.

Yıkama Çözeltisi: %10 metanol ve %7 asetik asit çözeltisinden oluĢmaktadır. Jelin HazırlanıĢı: Protein kontaminasyonunu ve her türlü kirliliği önlemek için bütün iĢlemler eldiven giyilerek yapıldı. Elektroforez camları %70‘lik etanolle

iyice temizlendikten sonra jelin sızmasını önlemek için standına yerleĢtirildi. Cam levhalar arasında sızıntı olup olmadığı kontrol edildikten sonra, hava kabarcığı kalmayacak Ģekilde gazı alınmıĢ %7.5‘lik ayırma jeli, TEMED ve amonyum persülfat ilave edildikten sonra karıĢtırıldı. Hazırlanan jel mini elektroforez (Bio-Rad, Mini-PROTEAN, ABD) cam levhalar arasına döküldü. Ayırma jelinin içeriği Çizelge 3.10‘ da verildi.

Jelin havayla temasını kesmek için, üzeri %70‘lik etanolle kapatıldı ve jelin polimerleĢmesi için 1 saat bekletildi. Süre sonunda ayırma jelinin üzerindeki alkol kurutma kâğıdı ile jele temas etmeden yavaĢ yavaĢ alındı ve üzerine %4‘lük yoğunlaĢtırma jeli döküldü. Tarak, jelle arasında hava kabarcığı kalmamasına ve ayırma jeline değmemesine dikkat edilerek jele yerleĢtirildi ve polimerleĢmesi için 1-2 saat beklendi. YoğunlaĢtırma jelinin içeriği Çizelge 3.11‘de verildi.

Çizelge 3.10. Ayırma jelinin (%7.5) içeriği

Jelin Ġçeriği Miktar (mL)

Distile su 2.046

Ayırma tamponu (pH 8.8) 1.00

%30‘luk akrilamid/N,N‘-metilenbisakrilamid 1.249

%2‘lik çözünür niĢasta 0.625

%10‘ luk SDS (SDS-PAGE için) 0.050

%10‘luk amonyum persülfat 0.025

TEMED 0.00175

Çizelge 3.11. YoğunlaĢtırma jelinin (%4) içeriği

Jelin Ġçeriği Miktar (mL)

Distile su 1.875

YoğunlaĢtırma tamponu (pH 8.8) 0.25

%30‘luk akrilamid/ N,N‘-metilenbisakrilamid 0.3375

%10‘ luk SDS (SDS-PAGE için) 0.025

%10‘luk amonyum persülfat 0.0125

3.3.10.3. Örneklerin hazırlanıĢı ve jele uygulanıĢı

Jele uygulanacak örnekler ve standart, örnek tamponuyla uygun seyreltmeleri yapıldıktan sonra kaynar su banyosunda 5 dakika kaynatıldı. (PAGE için örnekler kaynatılmadı). Tarak jele zarar vermeden çekildi ve jel elektroforez tamponu ile yıkanarak polimerleĢmeyen jel uzaklaĢtırıldı. Daha sonra kuyucuklar elektroforez tamponu ile dolduruldu ve uygun seyreltmeleri yapılan örneklerden 15 µL yüklendi. Örnekler jele yüklendikten sonra jel tankın içine yerleĢtirildi ve kuyucukların üzerini örtecek Ģekilde elektroforez tamponu eklendi. Güç kaynağı (UVP, Almanya) ile 200 V 45 dakika 20 mA elektrik akımı verilerek proteinlerin ayırma iĢlemi yapıldı.

3.3.10.4. Jelin boyanması

Cam levhalar arasından çıkarılan jelden üst jel ayrıldı. Boyanın aldığı yol elektronik kumpasla ölçüldükten sonra, protein boyaması yapıldı. Coomassie Blue G-250 çözeltisi ile 1 saat 100 rpm‘de çalkalanarak boyandı. Boyamadan sonra jeldeki fazla boya yıkama çözeltisi ile 100 rpm‘ de yıkanarak uzaklaĢtırıldı ve bantlar görünür hale geldi.

3.3.10.5. Zimografi

Zimografi için cam plaklar arasından çıkarılarak ayrılan jel, 50 mM pH 5.5 Mcllvaine tamponunda hazırlanmıĢ %1‘lik çözünür patates niĢastası içinde 4 ºC‘da 1 saat inkübe edildi. Jel aynı çözelti içerisinde 50 ºC‘da 1 saat etüvde inkübe edildi. Jel niĢastadan çıkarılıp distile su ile yıkandı. Yıkama iĢleminden sonra iyot çözeltisinde (%0.3 I2-%0.6 KI) bantlar belirginleĢene kadar bekletildi. Gerekli ölçümler yapıldıktan sonra aynı çözelti içerisinde saklandı

.

3.3.10.6. Amilazın molekül ağırlığının hesaplanması

Elektroforez sonucunda PAGE ve SDS-PAGE sonuçları karĢılaĢtırılarak amilaz bantları belirlendi. SDS-PAGE jelinde boyanın, standartların ve enzimin kat ettikleri mesafeler elektronik kumpas (Mitutoyo, CD-15CP, Ġngiltere) yardımı ile ölçüldü. Standartların ve enzimin Rf değerleri aĢağıdaki formül kullanılarak hesaplandı:

𝑹𝒇 =^𝑷𝒚 𝑱𝒃 ^×

𝑶𝒃 𝑰𝒚 Py= Boyamadan sonra taĢınan proteinin aldığı yol

Jb= Boyamadan sonraki jelin boyu

Ob= Boyamadan önceki jelin boyu

Iy= Boyamadan önceki iĢaretleyicinin (boyanın) aldığı yol

Standartların molekül ağırlıklarının logaritması alındı ve Rf değerlerine karĢı grafik çizildi. Elde edilen standart grafiğin denkleminden yararlanılarak enzimin molekül ağırlığı saptandı.