Amilazın SaflaĢtırılması

AO= Adsorpsiyon oranı

O= BaĢlangıç enzim aktivitesi

R= Geride kalan enzim aktivitesi

3.3.9. Amilazın SaflaĢtırılması

A. fumigatus HBF125‘in kültür koĢullarının optimizasyonu yapıldıktan sonra saflaĢtırma iĢlemlerine geçildi. Optimum koĢullarda enzim üretimi yapılarak belirlenen optimum günde (2. gün) kültür ortamı süzüldü. Süzüntü ―ham ekstrakt‖ olarak adlandırıldı ve enzim kaynağı olarak kullanıldı.

SaflaĢtırmada ilk adım olarak amonyum sülfat çöktürmesi yapıldı, daha sonra ultrafiltrasyon ve niĢasta afinite kolon kromatografisi uygulandı. Aksi belirtilmedikçe tüm saflaĢtırma adımları 4 °C‘de yapıldı.

SaflaĢtırma boyunca elde edilen fraksiyonlarda aktivite ve protein tayinleri belirlenen standart koĢullarda yapıldı. Ham ekstrakt olan ekstraselüler sıvının saflaĢtırma katsayısı 1 kabul edilerek ve diğer fraksiyonların özgül aktiviteleri ham ekstrakt spesifik aktivitesine oranlanarak saflaĢtırma katsayıları hesaplandı. Fraksiyonların yüzde verimlerini belirlemek için ham ekstrat verimi 100 olarak kabul edilerek ve fraksiyonların total aktivitesi ham ekstrakt total aktivitesine oranlanarak yüzde verimleri hesaplandı. Elde edilen veriler saflaĢtırma çizelgesi oluĢturularak özetlendi.

(O-R)

AO(%)= x100

O

3.3.9.1. Amonyum sülfat çöktürmesi

SaflaĢtırmanın ilk adımlarında daha çok deriĢtirmeye yönelik teknikler kullanılır. Enzim saflaĢtırmada en çok kullanılan tekniklerden biri, yüksek tuz konsantrasyonlarında çöktürmedir. Proteinlerin su içerisindeki çözünürlükleri çok azdır. Ortama bir miktar nötral tuz (NaCl ve (NH4)2SO4 gibi) ilave edildiğinde (düĢük iyonik kuvvet) proteinlerin yüzeyinde veya iç kısımlarında bulunan hidrofilik grupların su ile etkileĢim derecesi artar. Bu durumda proteinlerin çözünürlükleri de artar. Bu olaya ―salting in‖ denir. Protein çözeltisine çok miktarda nötral tuz ilave edildiğinde, proteinlerin genellikle iç kısımlarında yer alan hidrofobik gruplar etrafındaki su molekülleri tuz iyonları tarafından uzaklaĢtırılır. Bu durumda hidrofobik grupların birbirleri ile olan etkileĢimleri artar ve proteinler çökerler. Bu olaya ise ―salting out‖ denir. Protein çözeltisinde hidrofobik alanları büyük ve daha fazla olan proteinler, hidrofobik alanları küçük ve daha az olanlarınkine göre daha çabuk birbirleri ile etkileĢerek çökerler. Böylece proteinlerin fraksiyonlanması sağlanmıĢ olur (Metin vd., 2007).

Kültür ortamı süzüldükten sonra elde edilen ham ekstrakt amonyum sülfat çöktürme denemeleri için kullanıldı. Ham ekstrakt için ayrı ayrı %0-20, %20-40, %40-60, %60-80 ve %80-100 aralıkların da 4 °C da doymuĢ amonyum sülfat eklenerek çöktürme iĢlemleri yapıldı. Ġlk önce ham ekstrakta %20 konsantrasyonlarda amonyum sülfat eklenerek 4 °C da 2 saat manyetik karıĢtırıcıda yavaĢ yavaĢ karıĢtırılarak inkübe edildi. Süre sonunda çözelti 10000 x g de 30 dk santrifüjlendi. Süpernatant ve pellet birbirinden ayrıldı. Pellet 20 mM, pH 7.0, 4 °C Tris-HCl tamponunda çözüldü ve diyaliz iĢleminden sonra aktivite ve protein tayini yapıldı. Süpernatanta sırasıyla diğer konsantrasyonlarda amonyum sülfat eklenerek iĢleme devam edildi. Bütün fraksiyonlar için aĢağıda anlatıldığı gibi diyaliz yapıldı. Diyaliz iĢleminden sonra aktivite ve protein tayini yapıldı. Bütün fraksiyonlar için spesifik aktivite, saflaĢtırma katsayısı ve yüzde verim hesaplandı.

3.3.9.2. Diyaliz

Diyaliz yöntemi, iyonik olan ve olmayan tüm küçük molekülleri uzaklaĢtırmak için basit, ucuz ve etkin bir yöntemdir. Genellikle çözeltilerdeki tuzları ve diğer küçük molekülleri ortamdan uzaklaĢtırmakta kullanılır. Ayrıca biyolojik

moleküllere zayıf bir Ģekilde bağlı olan küçük iyonları ve molekülleri de bu yöntemle ortamdan uzaklaĢtırmak mümkündür (Metin, 2007).

Sırasıyla %0-20, %20-40, %40-60, %60-80 ve %80-100 amonyum sülfat çöktürmesi sonucu elde edilen pellet uygun hacimde 20 mM, pH 7.0, 4 °C Tris-HCl tamponunda çözüldü. Daha sonra yarı geçirgen bir membrandan oluĢan diyaliz torbası (Selüloz membran, Sigma-Aldrich, MWCO-Molecular Weight Cut Off 12.000 Da, 25 mm x 16mm) uygun uzunlukta kesildi. Tek tip gözenek büyüklüğü sağlamak ve ağır metal artıklarını gidermek için ön iĢlemden geçirildi (Çizelge 3.9). Diyaliz torbasına örnek aktarıldı ve her iki ucu klipsler yardımıyla kapatıldı. Daha sonra pelletlerin çözüldüğü ve içinde 10 mM CaCl bulunan aynı tampona karĢı 24 saat süreyle 2 defa değiĢtirilerek (toplam 1200 mL) diyaliz edildi. Diyaliz iĢlemi manyetik karıĢtırıcı üzerinde 4 °C‘ de gerçekleĢtirildi.

Çizelge 3.9. Diyaliz torbasının ön iĢlemden geçirilmesi

1 %0.3‘ lük sodyum sülfit çözeltisinde 80 °C‘ de 1 dakika bekletilir.

2 Sıcak su (60 °C) ile 2 dakika yıkanır.

3 %0.2‘ lik sülfürik asitte 1 dakika bekletilir.

4 Sıcak su (60 °C) ile 2 dakika yıkanır.

3.3.9.3. Ultrafiltrasyon

Kültür ortamı süzüntüsünden (420 mL) enzimi hem kısmi olarak saflaĢtırmak hem de konsantre etmek için ultrafiltrasyon yapıldı. Süzüntü 10.000 MWCO ultrafiltrasyon membranı içeren Vivacell 250 ultrafiltrasyon kabına (Sartorius, Almanya) aktarıldı. Azot gazı ile 4 bar basınç uygulayarak inkübatörde 10 °C da, 100 rpm‘lik hızda çalkalanarak konsantre edildi.

3.3.9.4. NiĢasta affinite kolon kromatografisi

SaflaĢtırma için Mendu vd. (2005) niĢasta affinite kromatografi metodunda kismi değiĢiklikler yapılarak kullanıldı. Bu iĢlem sırasında 8 g mısır niĢastası 50 mL 20 mM pH 7.0, 4 °C Tris-HCl tamponunda oda sıcaklığında manyetik karıĢtırıcıda 30 dk karıĢtırılarak ĢiĢmesi sağlandı. Daha sonra manyetik karıĢtırıcı kapatılarak niĢastanın çökmesi beklendi ve üst sıvı döküldü. NiĢasta üzerine tampon eklenerek manyetik karıĢtırıcıda, vakum altında havası alındı. Daha sonra niĢasta tampon karıĢımı homojen bir Ģekilde kolona (Bio-Rad, 1.5 cm x 10 cm) yüklendi. Kolon, peristaltik pompa (ATTO AC-2110, Japonya) yardımıyla belli bir akıĢ hızında 4

°C de 20 mM pH 7.0 Tris-HCl tamponu ile yıkandı. Böylece kolonunun hem tampon ile dengeye gelmesi sağlandı, hem de çözünür niĢastanın kolondan uzaklaĢtırılması sağlandı. Ultrafiltrasyon ile konsantre edilen ham enzim kolona yüklendi. Kolon, 60 mL/saat akıĢ hızında, 20 mM Tris-HCl tamponu ile yıkanarak istenmeyen proteinlerin uzaklaĢtırılması için yıkandı. Protein çıkıĢı 280 nm‘deki absorbans değerleri ölçülerek izlendi. Kolonda protein çıkıĢı gözlenmediğinde kolon oda sıcaklığına alındı. NiĢastaya bağlı amilazı uzaklaĢtırmak için, 20 mM pH 7.0 Tris-HCl tamponunda taze olarak hazırlanan dekstrin ile %0-1‘lik linear gradient yapıldı. Kolonda çıkan her fraksiyonda protein, proteaz ve enzim aktivitesi ölçüldü. Aktivitesi yüksek olan fraksiyonlar birleĢtirilerek dekstrinin uzaklaĢtırılması için diyaliz edildi. Diyaliz iĢleminden sonra aktivite ve protein tayini yapıldı. Son olarak fraksiyonlar enzimin saflığının kontrolü, ayrımın gerçekleĢip gerçekleĢmediğini ve molekül ağırlığının tayin için poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE) ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile zimografi yapılarak görüntülendi. Her saflaĢtırma iĢleminden önce kolon taze olarak hazırlandı.