DPPH radikallerini süpürme etkisi

Serbest radikal, atomik ya da moleküler yapılarda çiftlenmemiĢ elektrona sahip yapılara verilen isimdir. BaĢka moleküller ile kolayca elektron alıĢveriĢine girebilirler. (Çavdar ve ark., 1997). Bu da oksidatif strese sebep verir. Bir maddenin antioksidatif yönden etkili olup olmadığı ortamdaki bu serbest radikalleri süpürüp süpüremediği ile ilgilidir. Yapılan deneylerde A. caesarea'nın ortamdaki DPPH serbest radikallerini süpürme kapasitesi belirlenmiĢtir. DPPH‟in kalibrasyon eğrisinden ve ekstrelerin konsantrasyona bağlı değiĢim grafiklerinden IC50 değerleri hesaplanmıĢtır. IC50

değerleri ne kadar küçükse antioksidan aktivite de o kadar etkilidir (Pourmorad ve ark., 2006).Mantarların DPPH radikallerini süpürme etkisi artan konsantrasyona bağlı olarak artmıĢtır. DPPH radikali çözeltisinin mor renginin giderek açılması, deney ortamındaki radikallerin süpürüldüğünün belirtisidir. Mantarların DPPH radikallerini süpürme etkisi iyi sonuçlar vermiĢtir. Buna göre antioksidan standartları olan BHA ve BHT‟nin ortamdaki DPPH radikallerinin yarısını süpürebildikleri konsantrasyonları yani IC50

değerleri sırasıyla 0,35519mg/ml ve 0,4119mg/ml iken; A. caesarea‟nın 0,7615 mg/ml olarak belirlenmiĢ ve BHA çok düĢük bir IC50 değeri ile oldukça yüksek bir değerde

süpürme etkisi göstermiĢtir (ġekil 5.16.).

DPPH radikalini süpürme etkisi ile ilgili yapılan çalıĢmalar ise Ģöyledir:

Huang ve ark. [Shimada ve ark. (1992)] metodunu kullanarak, A.

belirlemiĢlerdir (Huang ve ark., 1999). Mau ve ark. D. indusiata‟ nın metanolik ekstraktının süpürme gücünü 6,4 mg/ml‟ de % 92 (Mau ve ark., 2002), Yang ve ark., ise ticari mantarlar (Flammulina velutipes, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus ve P.

cystidious)‟ın metanolik ekstraktlarının DPPH süpürme gücü 6,4 mg/ml‟ de % 42,9 - %

81,8 olarak tespit etmiĢler (Yang ve ark., 2002), yine aynı araĢtırıcılar Chao (2001) metodunu kullanarak Auricularia cinsinin türlerinden olan siyah ve kırmızı kulak mantarlarının 1 mg/ml‟de DPPH radikalini süpürme etkisini % 100, kar ve jin mantarının süpürme etkisini sırasıyla 0,4 mg/ml‟de % 94,5 ve 3 mg/ml‟de % 95,4 olarak belirlemiĢlerdir (Yang ve ark., 2002). Cheung ve ark. Chu, Chang ve Hsu (2000) metoduna göre V. volvacea‟nin metanolik ekstraktını 9 mg/ml‟de % 57.8 (Cheung ve ark., 2003), Mau ve ark. 10 mg/ml konsantrasyonda Termitomyces albuminosus % 78.8,

Grifola frondosa % 79,9 ve çok iyi bir etki gösteren Morchella esculenta‟yı % 94,1

olarak tespit etmiĢlerdir (Mau ve ark., 2004). Cui ve ark. Cune ve Jhons (2002) metoduna göre Inonotus obliquus‟ un polifenol etanolik ekstraktını 50 µg/ml‟ de % 81,8 (Cui ve ark., 2005), Zhan ve ark. ise Blois (1958) metoduna göre Cordyceps militaris‟in süpürme etkisinin artan konsantrasyona bağlı olarak arttığını ve 0.5-5 mg/ml arasında % 80‟i aĢtığını tespit etmiĢlerdir (Zhan ve ark., 2006). Tsai ve ark. Blois (2002) metoduna göre Lepista nuda, Russula delica, Polyporus squamosus, Pleurotus ostreatus, Agaricus

bisporus, Verpa conica ve Boletus badius‟un 180 µg/ml‟ de DPPH radikalini süpürme

etkilerini: BHA (97,4) > α-tocopherol (95.4) > Lepista nuda (91,3) > Russula delica (86,1) > Polyporus squamosus (82,8) > Pleurotus ostreatus (81,3) > Agaricus bisporus (77,5) > Verpa conica (75,7) > Boletus badius (68,7) olarak tespit etmiĢlerdir (Tsai ve ark., 2007 ). Yine Lee ve ark. Tayvan‟da yeni bir besin olarak tüketilen Hypsizigus

marmoreus‟un fruktifikasyonu ve misellerinin etanol ve sıcak su ekstraktlarından,

etanol ekstraktlarındaki DPPH süpürme etkisi 5 mg/ml‟de; fruktifikasyon ve misellerinde % 75,5 olarak tespit edilirken, sıcak su ekstraktındaki fruktifikasyon % 36,8 ve misellerinde ise % 55,5 olarak belirlemiĢlerdir (Lee ve ark. 2008). Yaltırak ve ark., Blois (1958) metodu kullanarak spektrofotometrik yöntem ile Russula delica‟nın DPPH radikal süpürme etkisini 10 mg/ml‟de % 26, demir iyonları üzerinde bağlayıcı etkisini 5 mg/ml‟de % 58 olarak tespit etmiĢlerdir (Yaltırak ve ark., 2009).

ÇalıĢmamızda 0,5 mg/ml‟de A. caesarea % 40,91 gibi değere ulaĢırken; standartlar, BHA % 60.6, BHT % 53 değerlerini vermiĢtir (Çizelge 4). Yapılan çalıĢmalar ile kıyasladığımızda A. caesarea düĢük konsantrasyonlarda inhibisyon yüzdesi ile oldukça iyi sonuç vermiĢtir (ġekil 5.17.).

6.1.3. Ġndirgeme gücü

BileĢenlerin indirgeme kapasitesi onun antioksidan yönünden aktivitesini belirlemektedir (Meır ve ark., 1995). Test çözeltisinin sarı rengi, ortamda bulunan antioksidan maddelerin indirgeme aktivitelerinden dolayı farklı tonlarda yeĢil renge dönüĢmektedir (Gülçin, 2006). Ġndirgen olarak görev alan antioksidan maddelerin etkisiyle Fe3+/ferriksiyanit kompleksi Fe+2/ferrosiyanit kompleksi olan ferröz formuna indirgenir. OluĢan bu kompleks ilave edilen FeCl3 ile Prusya mavisi Fe4[Fe(CN)6]3

kompleks oluĢturarak 700 nm‟de maksimum absorbans verir. Deneylerde kullanılan mantar ekstrelerinin indirgeme kapasitesi de toplam antioksidan aktivite gibi mantar ekstre konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak artmaktadır. Belirlenen grafiklerde (ġekil 18), indirgeme gücü en fazla olan BHA‟dır. A. caesarea ise 1,2 mg/ml‟de 0,451 indirgeme kapasitesine sahiptir. Konsantrasyon arttıkça artan absorbans değeri indirgeme yeteneğini gösterir. Mantarın indirgeme gücü ne kadar yüksekse antioksidan aktivite de o derece etkilidir.

Mantarların indirgeme gücü ile ilgili yapılan çalıĢmalardan elde edilen veriler ise Ģöyledir:

Oyaizu (1986) metoduna göre yapılan çalıĢmalarda; Huang ve Ark. Agaricus

blazei‟nin 10 mg/ml‟de 0,86, Antrodia camphoratha‟nın ise aynı konsantrasyonda

0,96–0,97 indirgeme gücünü (Huang ve ark., 2000), Yang ve ark., 40 mg/ml‟de mantarların indirgeme gücü 1,28‟den yüksek [sıralama ise Pleurotus ostreatus ≈ P.

cystidiosus > Lentinula edodes > Flammulina velutipes (sarı) > L. edodes (271) ≈ F. velutipes (beyaz)] gözlemlemiĢler (Yang ve ark., 2002), ElmastaĢ ve ark., 200 µg/ml‟de Russula delica (1,32 µg/ml) ve Verpa conica (1,22 µg/ml)‟nın çok güçlü indirgeme

gücüne sahip olduklarını tespit etmiĢlerdir (ElmastaĢ ve ark., 2007). Sarıkürkçü ve ark.

Amanita caesarea, Clitocybe geotropa ve Leucoagaricus pudicus‟un 2 mg/ml‟de

indirgeme güçlerini (0,3 mg/ml) olarak bulmuĢlar ve konsantrasyon artırıldığında 20 mg/ml‟de A. caesarea (1,5 mg/ml), C. geotropa (1,2 mg/ml) ve L. pudicus (1,3 mg/ml) olarak belirlemiĢlerdir (Sarıkürkçü ve ark., 2010).

Elde ettiğimiz sonuçları yapılmıĢ olan çalıĢmaların indirgeme gücü verileri ile kıyasladığımızda 0,3 mg/ml‟de A. caesarea (0,288)‟yı, diğerleri ile kıyasladığımızda birçok mantardan daha yüksek bir indirgeme gücüne sahip olduğu anlaĢılmaktadır. Oldukça düĢük konsantrasyonda birçok mantara göre mükemmel indirgeme kapasitesine sahip olduğu gözlenmiĢtir.

6.1.4. –Karoten–Linoleik asit sisteminde mantarların antioksidan aktivitesinin belirlenmesi

β-karoten, hücrelerin dayanıklılığını arttırır ve gereksinim halinde vücutta A vitaminine dönüĢtürülür. Vitamin A'nın ön maddesi olan β-karotenin singlet oksijeni bastırabildiği, süperoksit radikalini temizlediği ve peroksit radikalleriyle direkt olarak etkileĢerek antioksidan görev gördüğü saptanmıĢtır. Karotenoidlerin antioksidan aktivitelerine bağlı olarak kanser oluĢumunu inhibe ettikleri pek çok araĢtırıcı tarafından rapor edilmiĢtir. Bu deneylerde, linoleik asitin ısı ve hava etkisiyle oksidasyonunu, gerek mantar ekstresi gerekse standart antioksidan maddelerle engellenmesi amaçlanmıĢtır. Kontrol çözeltisi olarak β-karoten-linoleik emülsiyon çözeltisi hazırlanmıĢtır. Bu sistemde β-karoten, linoleik asidin maruz kaldığı oksidasyonun belirli bir kısmını engellemektedir. Mantarların, linoleik asidin oksidasyonunu engelleme yüzdeleri, antioksidan standartları olan BHA ve BHT ile kıyaslanmıĢtır. Yapılan hesaplamalarda absorbans değiĢim oranı (AO) ve buna bağlı olarak da % oksidasyonu engelleme katsayıları hesaplanmıĢtır. Grafiklere bakıldığında (ġekil 19) kontrol numunesinin absorbans eğrisi en altta, yani ortamdaki linoleik asidin oksidasyonu sadece β-karoten ile engellenmeye çalıĢılmakta, mantar ekstrelerinin ve standart antioksidan maddelerin zamana bağlı olarak absorbans eğrileri ise kontrol numunesinin üzerinde seyir göstermektedir. Bunun anlamı ortama katılan ekstre (ihitiva ettiğini düĢündüğümüz antioksidan etkili yapıları) veya standartlar, β-karoten ile sinerjik etki yapmakta, dolayısıyla linoleik asidin oksidasyonunu daha da fazla engellemektedirler.

Yapılan çalıĢmalara baktığımızda; Soares ve ark. Agaricus brasiliensis‟in genç ve olgun örneklerinin metanolik ekstraktlarının antioksidan aktivitesini β-karoten ile değerlendirmiĢler, T0 anından 120. dk‟ya kadar 3 defa ölçüm yapılarak ortalamasını

almıĢlardır. Gıda, kozmetik ve ilaçlarda standart olarak kullanılan; sentetik bir antioksidan olan BHT kontrol olarak kullanmıĢlar 0,2 mg/ml‟de oksidasyonu engelleme yüzdesi % 92 olarak bulmuĢlardır. Mantarın genç ve olgun ekstraktlarında ise 10 mg/ml‟de % 90 oksidasyon engelleme yüzdesi tespit etmiĢlerdir (Soares ve ark., 2009). Yine Gürsoy ve ark. yedi Morchella (Morchella rotunda, M. esculenta var. umbrina, M.

deliciosa, M. elata, M. conica ve Morchella angusticeps)‟dan β-karoten/linoleik asit

sistemini, M. esculenta var. umbrina ve M. angusticeps (4,5 mg/ml‟de sırasıyla % 96,89 ve % 96,88)‟de en aktif tespit etmiĢlerdir (Gürsoy ve ark., 2009). Sarıkürkçü ve ark.

pudicus’ta (25,5 mg/ml‟de % 81,8) gözlemlemiĢler ve bunu sırasıyla A. caesarea ( %

70,1) ve C. geotropa (% 61,3) takip etmiĢtir (Sarıkürkçü ve ark., 2010). A.caesarea‟yı yaptığımız çalıĢma ile kıyasladığımızda ise bizim çalıĢmamızda 2,284 mg/ml‟de % 71,29 ile daha yüksek oranda β-karoten/linoleik asit sistemi tespit edilmiĢtir.

Elde edilen sonuçlara göre A.caesarea‟yı yapılan çalıĢmalarla kıyaslandığımızda düĢük konsantrasyonlarda bile oldukça yüksek sonuçlar elde edilmiĢtir.

T0 anından 120. dakikaya kadar yapılan ölçümlerden sonra elde edilen verilerin

(Çizelge 6) oksidasyonu engelleme yüzdeleri sıralandığında BHA (% 85,1405) > BHT (% 64,5875) > A. caesarea (% 71,296589) sırasında olduğu görülür. Bunu sütun grafiğinde daha açık bir Ģekilde görebiliriz (ġekil 5.20.).