Lazer Doppler Elektroforezi

Lazer Doppler elektroforez tekniği, aslında iki ayrı yöntemin birleştirilmesiyle geliştirilmiştir: lazer Doppler hız ölçümü ve elektroforez. Bir elektroforetik ışık saçılması tekniğidir. Elektroforez, bir elektrolite elektrik alan uygulandığında, elektrolit içinde bulunan parçacıkların kendilerine ters işaretli elektrotlara çekilmeleridir. Viskoz kuvvetler, parçacıkların bu hareketine karşı koyarlar. Bu zıt kuvvetler arasında denge oluştuğunda, parçacıklar sabit bir hızla hareket etmeye başlarlar. Bu hız, uygulanan elektrik alanın şiddetine, ortamın dielektrik sabiti ile viskozitesine ve zeta potansiyeline bağlıdır. Bütün bu değişkenler birbirine Henry denklemiyle bağlanır. Henry denklemi şöyledir:

η

ξ

ε

Burda UE, elektroforetik mobilite; ε, ortamın dielektrik sabiti; z, zeta potansiyeli; f(ka), Henry fonksiyonu; η ise ortamın viskozitesidir. Parçacıkların bir elektrik alan altındaki hızlarına özel olarak elektroforetik mobilite denir. Dielektrik sabiti ise, bir ortamın (veya genel olarak bir maddenin), uygulanan elektrik alanını geçirgenliğinin ölçüsüdür.

Henry denklemi, Şekil 3.22’de gösterilen sistemin matematiksel modellemesinin çözülmesiyle elde edilir ve Henry fonksiyonu da bu çözümde kendiliğinden ortaya çıkar. Henry fonksiyonu f (ka)’daki “k” parametresinin tersi olan 1/k değeri, elektrik çift tabakanın genişliğidir ve Debye uzunluğu adını alır (Şekil 3.24). “a” parametresi ise parçacığın kendi yarıçapıdır. Bu fonksiyonla ilgili genel olarak iki yaklaşım yapılır: Fonksiyonun değerini polar ortamlar için Smoluchowski, apolar ortamlar için de Hückel çeşitli yaklaşımlarla hesaplamışlardır. Smoluchowski yaklaşımında f (ka)=1,5 , Hückel yaklaşımında ise f (ka)=1 olarak bulunmuştur. Dolayısıyla adı her ne kadar fonksiyon da olsa, Henry denkleminde ya 1,5 ya da 1 değeri bir sabit gibi kullanılır.

Şekil 3.24 a yarıçaplı parçacığın etrafında gri renkte elektrik çift tabakası görülüyor. Bu tabakanın uzunluğu 1/k olup k parametresi denklemdeki potansiyel alanın sınır koşullarından

gelir.

Henry denkleminde sadece elektroforetik mobilite ve zeta potansiyeli değişkendir. Böylece elektroforetik mobilite ölçülebilirse, denklemden zeta potansiyeli hesaplanabilir. Elektroforetik mobilitenin ölçülmesi için, partiküllere elektrik alan uygulanır. Bu yüzden, numune bu iş için özel olarak yapılmış bir tür kapiler küvete konur. Küvetin iki ucunda elektrotlar vardır ve bu elektrotlar sayesinde numuneye elektrik alan uygulanır (Şekil 3.25). Numune, U şeklindeki gri renkli kısımda yer alır. Elektrotlara kutupları sürekli değişen bir elektrik akımı uygulanır. Şekilde, soldaki elektrot pozitif, sağdaki elektrot negatiftir ancak ölçüm sırasında işaretler sürekli değişir. Bu değişim, saniyede 50 kereye kadar çıkar. Böylece numune içindeki yüklü parçacıklar, kendilerine zıt işaretli elektrotlara doğru çekilirler ve bu çekilme de, kutupların yer değiştirmesine paralel olarak sürekli yön değiştirir. Yani parçacıklar bir sağa bir sola hareket ederler yani salınım yaparlar.

Şekil 3.25 Bir kapiler küvet (Zetasizer Nano Series User Manual).

Parçacıkların bu salınımı sırasındaki hızları (yani elektroforetik mobiliteleri) ölçülür. Bu ölçüm için, Lazer Doppler Hız Ölçümü yöntemi kullanılır. Şekil 3.26’de Zetasizer cihazının

iç yapısı görülmektedir. Zeta potansiyeli ölçümünde önce lazer kaynağından bir lazer ışın demeti çıkar. Bu demet, ışın bölücüden geçerken ikiye ayrılır; gelen ışığın bir kısmı referans ışığı olarak doğrudan birleştirici optik sisteme gönderilir, diğer kısmı ise zayıflatıcıdan geçerek küvetin üzerine düşürülür. Zayıflatıcının görevi, numune üzerine ölçüm için uygun şiddette ışık düşmesini sağlamaktır. Daha sonra, ışık numune içinden geçerken saçılmalar olur ve 13°’lik açıyla saçılan ışınlar bir düzeltici optik sisteme gelir. Düzeltici optik sistem, dispersantın kendisinden olabilen saçılmaları ayıklamak için kullanılır. Daha sonra bu ışınlarla referans ışınlar birleştirilir ve detektöre gönderilir. Detektörde ışınlar elektriksel sinyallere çevrilir ve bu sinyaller dijital sinyal işlemcisinde analiz edilir. Sonuçlar da bilgisayarda görüntülenir.

Şekil 3.26 Zetasizer cihazının iç yapısı (Zetasizer Nano Series User Manual).

Demek ki numuneye bir yandan elektrik alan uygulanıp yüklü partiküllerin salınım yapması sağlanıyor, bir yandan da bu partiküllerden saçılan ışık analiz ediliyor. Bu analizin anahtar noktası, ışığın frekansındaki Doppler kaymasıdır. Doppler kayması, dalgalara özgü bir özellik olup, kaynak veya gözlemcinin en az birinin hareket etmesiyle gerçekleşir (Şekil 3.27). Doppler kayması (ya da olayı), kaynakla gözlemci arasında bağıl bir hareket olduğunda, gözlemcinin algıladığı dalganın frekansının, kaynaktan çıkan dalganın frekansından farklı olmasıdır. Şekilde noktasal bir kaynaktan yayılan dairesel dalgalar görülmektedir. İçiçe çizili

her bir çember, dalganın tepe noktasını temsil etmektedir. İki tepe noktası arası (yani iki çember arası) uzaklık, dalga boyudur. (a)’da hem kaynak hem de gözlemci durgundur, dolayısıyla dalgaboyu da değişmemektedir. (b)’de ise kaynak, gözlemciye doğru hareket etmektedir. Kaynaktan çıkan bir dalga tepesi ilerlerken, kaynağın kendisi de hareket etmektedir ve böylece kaynaktan çıkan bir sonraki dalga tepesiyle önceki dalga tepesi arası uzaklık yani dalga boyu değişmektedir. Bunun sonucu olarak, kaynağın ilerleme yönünde dalga boyları kısalmakta, kaynağın ilerleme yönünün tersinde ise dalga boyları uzamaktadır. Dalga boyu ile frekans ters orantılıdır. Dalga boyu değiştiğinde frekans da değişir.

Şekil 3.27 Şekilde noktasal bir kaynaktan yayılan dairesel dalgalar görülmektedir. (a)’da hem kaynak hem de gözlemci durgundur, dolayısıyla dalgaboyu da değişmemektedir. (b)’de ise

kaynak, gözlemciye doğru hareket ettiğinden, dalga boyu değişmektedir.

Özetlersek, kapiler hücre içinde, yüklü parçacıklara yönü sürekli değişen bir elektrik alan uygulanıp, parçacıkların salınım yapması sağlanıyordu. Parçacıkların yükleri ne kadar büyükse, elektrik alandan o kadar çok etkilenecek ve bir o kadar daha hızlı hareket

edeceklerdir. Bir yüklü parçacığın, kendisine zıt işaretli elektrot tarafından çekilme kuvveti, parçacığın yükü ile doğru orantılıdır. Çekilme kuvveti ne kadar büyükse, partikülün hızı da o kadar büyük olur. Salınım yapmakta, yani hızları sürekli olarak değişmekte olan bu parçacıklara frekansı bilinen bir lazer ışığı düşürülmekte, ve parçacıklardan saçılan ışık, referans ışığıyla karşılaştırılarak analiz edilmektedir. Eğer parçacık hareket etmiyor olsa, saçılan ışığın frekansı değişmezdi. Fakat parçacık hareket ediyorsa, bu parçacıktan saçılan ışıkta yukarıda anlatıldığı üzere Doppler kayması görülür. Parçacıkların hız değişimleri ne kadar büyükse, ölçülecek Doppler kayması da o kadar büyük olacaktır. Partiküllerin hızları da yük miktarlarına bağlı olduğundan dolayı, frekanstaki kaymanın ölçümüyle, parçacıkların hız değişimleri bulunabilir, buradan da Henry denkleminden zeta potansiyeli hesaplanabilir (Dalgakıran, 2006).