1. Etüv ( İnkübatör ): Mikroorganizmalar kültür ortamlarına ekildikten sonra çoğalmalarını sağlamak için, belirli bir ısı derecelerinde tutulmaları gerekir. Bu amaç için kullanılan aletlere etüv veya inkübatör denir. İnkübatör sabit sıcaklık her zaman ve her yerinde aynı olmalı veya
± 0,5° C’ lik bir farktan büyük olmamalıdır. İnkübatör istenilen dereceye ayarlanır. Sahip olduğu termostat sayesinde devamlı aynı dereceyi muhafaza eder. Alete eklenmiş olan bir termometre ile ısının kontrolü yapılır.
2. Distile ( Damıtık ) su cihazı: Besi yerleri veya diğer solüsyonlar için çok lüzumlu olan saf suyu elde etmede kullanılan aletlerdir. Madeni veya camdan yapılmış örnekleri vardır, Isı ile buharlaşan su özel soğutucu ile yoğunlaştırılarak tekrar saf su halinde toplanır.
4. Terazi: Uygun ağırlıkla 150 g. yüklemede en azından 0,1 gram hassasiyeti sağlayan teraziler ile l0 gramın altındaki yüklemelerdeki (2 g.'dan daha az) tartım için 0,0l g.
hassasiyete sahip analitik teraziler kullanılır.
5. pH metre: Sıvı besi yerlerinin ve diğer sıvıların pH değerlerini doğrulamak için, en azından 0,1 hassasiyetinde elektrometrik pH metreler kullanılır. Elektrik veya pille çalışan aletlerdir. Değişik modelleri vardır.
6. Santrifüj: Bir sıvıda bulunan mikroorganizmaları, hücreleri, partikülleri çöktürmede ve sıvıları berraklaştırmada santrifüjlerden yaralanılır. Laboratuarlarda amaca yönelik çeşitli santrifüjler kullanılır. Bunların bazıları orta (normal santrifüj) diğerleri yüksek devirli (ultra santrifüj) olduğu gibi bir kısmı da soğutmalıdır (soğutmalı santrifüj). Çöktürülecek maddenin çapı ne kadar büyük olursa çökme o derece hızlı olur. Örneğin, kan hücreleri 1000, bakteriler 4000 - 5000 ve virüsler 50.000 -100.000 dak. / dev.(=rpm.) de çökebilirler
7. Koloni Sayıcılar
a) Que- bec Tipi Koloni Sayıcısı: Plaklardaki kolonilerin sayımında kullanılır. Karanlık saha modeli tercih edilir. Sayıcı yeterli görünüş ve 1,5 çapında eşdeğer büyütme sağlamalıdır.
b) Binoküler Mikroskop Tipi Koloni Sayıcısı: Membran filtredeki kolonilerin sayımında l0-15x büyütmeli binoküler mikroskop kullanılır. Kolonilerin üstünde 60-80' 'lik açıda ışık kaynağı olarak gün ışığı flüoresanı temin edilmelidir. Düşük açılı aydınlatma pigment oluşturmayan koloniler için kullanılır.
c) Mekanik Koloni Sayıcı: Mevcut kolonilerin sayımı için kullanılan basit koloni sayıcısıdır.
8. Pipet Kapları: Alüminyum veya paslanmaz çelikten yapılmış, yaklaşık 40cm uzunluğunda 5 – 7,5 cm çapında silindir veya dikdörtgen kutulardır. Ambalaj kâğıdı veya toksik olmayan kâğıtlar da pipetlerin muhafazası için kullanılabilir. Pipet kapları olarak bakır ve bakirli bileşiklerden yapılmış, sülfatlı kağıtlar kullanılmaz.
9. Buzdolabı: Besiyeri, çözelti, numune v.b.’lerini saklamak için, 1-4.4 Cº sıcaklığı sağlayan buzdolabı kullanılır. Uçucu solventler, besin veya buzdolabında bozulacak ortamlar
10. Membran Filtre Ekipmanı: Filtre hunisi ve membran konan yuva, paslanmaz çelik, cam veya otoklava dayanıklı plastikten yapılmış olanı kullanılır. Korozyona sebep olacak ve otoklava dayanıksız olanlar kullanılmaz. Standart laboratuar filtrasyon ekipmanı ve ihtiyaç duyulan işlemler için kullanılır.
11. Arazi inkübatörü: Arazideki çalışmalar için uygun sıcaklığı, akü, pil v.b. enerji kaynağı kullanılarak sağlanabilen inkübatördür.
12. Arazi Milipor Takımı: Arazi çalışmalarına uygun olacak şekilde dizayn edilmiş membran filtre süzme takımıdır.
4. LABORATUAR KAZALARI VE ÖNLEMLERİ
Laboratuarda çalışanlar birçok kazalarla karşı karşıya gelir ve bazı durumlarda da bunları hayatlarıyla öderler. Bu tehlikeleri minimum sınırlara indirmek, çalışan insanların dikkat, deneyim ve bilgisi ile mümkün olmaktadır.
Mikrobiyoloji laboratuar kazalarının en başında enfeksiyona yakalanmak gelmektedir. Buna engel olabilmek için önceki bölümde bildirilen kurallara dikkatle uymakla mümkündür. Bazı durumlarda ne kadar dikkat edilirse edilsin yine de enfeksiyon alınabilir. Bunun başlıca nedenleri arasında, laboratuarda çalışan personelin ve öğrencilerin aynı titizliği göstermemesi ve bazı önemli noktalara uymamasından ileri gelmektedir. Mikrop insanı ve hatayı genellikle affetmez. Dikkat edilmesi gereken diğer önemli husus da, yanımızda çalışanları korumak ve onların hastalık almalarını önlemektir. Laboratuarda meydana gelebilen önemli bazı kazalar şunlardır;
Virulent kültür yutma: Önce ağız bol su ile yıkanır ve gargara edilir. Sonra 1/2000 bichloride mercur veya sulu hidrojen peroksitle ağız dezenfekte edilir. Lüzumu halinde etkene göre aktif immunizasyon, antibiyotik veya antiserum tatbik edilebilir.
Kesik yaraları: Laboratuarda çalışırken cam, tüp, pipet v.s. kırılması sonucu büyük kesik yaralan oluşabilir.
Yapılacak ilk iş, yaradaki cam veya diğer yabancı cisimleri hemen çıkarmak ve oksijenli su ile temizleyerek tentüre diode sürmektir. Ancak tentüre diodenin yaranın her yerine temas ettiğine dikkat edilir. Yara çok fazla büyük değil ve kanamıyorsa, tentüre diode den sonra üzerine flaster tatbik edilebilir. Orta derecede ve kanayan yaralar oksijenli su ile yıkandıktan sonra tazyikli bandaj konabilir. Kanama çok fazla ise turnike tatbik edilir ve hasta en yakın sağlık kuruluşuna gönderilir.
Yanmalar: Sıcak bir maddenin değmesi sonucu oluşan yanmalarda yara üzerine butesin picrat, veya diğer yanık merhemlerinden sürülerek iyice pansuman edilir. Kabarcıklar oluşmuşsa aseptik koşullarda açılarak içi boşaltılır ve pansuman tatbik edilir.
Kuvvetli asitler, chlorine, bromine v.s. ile yanmada yara yeri Önce su ile bolca yıkanır. Sonra Sodium bicarbonate (%5) veya Ammoniyum hidroksit ( %5) solüsyonu ile pansuman edilir.
Kuvvetli alkaliler, NaOH, metalik sodium, potasyum veya diğer maddeler sonu oluşan yanmalarda, yara yeri su ile bolca yıkanır. Yara yerine %5 Borik asit veya Asetik asit sürülür ve pansuman yapılır. Fenol yanıklarında, yara yerine alkol sürülür.
Sonra pansuman uygulanır. Eğer göze asit kaçmış ise, önce göz bol su ile yıkanır sonra göz
%5 sodium bicarbonatla, alkali kaçmışsa, %5 borik asitle yıkanır.
Mineral asit yutma: Eğer mineral asit yutulmuşsa hemen su ile ve alkali solüsyonla ağız çalkalanır. Milk of magnesia veya Calcine magnesia içilir ve kısa aralıklarla verilmeye devam edilir.
Kostik alkali yutulması: Ağız su ile ve hafif asitle bolca yıkanır, sonra limon suyu, sirke veya
%5 Asetik asit verilir. Ayrıca zeytinyağı, pamuk tohumu yağı veya diğer yağlardan biri içirilir. Kusturulmaya da çalışılabilir.
Fenol ve fenol bileşikleri yutma: Ağız, %30-40 dilue alkolle yıkanır. Hemen hastaya 1 kısım alkol + 1 kısım su karışımı içirilir. Kusturmaya çalışılır veya mide boşaltılır.
Yakıcı gaz koklama: Hasta temiz havaya çıkarılır, yüzü yere doğru yatırılır, başı göğsünden aşağıda olmak üzere tutulur ve akciğerden yakıcı gaz boşaltılır. Eğer ammonyak ciğerlere kaçmışsa Asetik asit, eğer asit kaçmışsa sulandırılmış ammonyak koklatılır. H2S için, %5 Ammonyum hidroksit koklatılır. Ayrıca süt, yumurta akı, zeytinyağı verilir.
5. SU ORTAMLARINDAN BAKTERİYOLOJİK NUMUNE ALMA YÖNTEMLERİ VE DİKKAT EDİLECEK NOKTALAR
Çevre mühendisliği açısından bakteriyolojik incelemeye alınacak olan su örnekleri esas olarak iki ayrı grupta ele alınmalıdır.
1. içme suyu veya sportif amaçla kullanılan sular; şebeke, kaynak ve kuyu, deniz ve yüzme havuzu suları
2. Kirlenmiş sular (atık sular); biyolojik arıtıma giriş ve çıkış suları ile kirletilmiş olan nehir, göl, haliç, körfez vb’den alınacak sular.
Numune almadan önce yapılması gerekli çalışmalar;
500 mL’lik renkli, şiliftli cam kapaklı şişeler iyice temizlenip sterilize edilmelidir. Klorlanmış olan numuneler için sterilize öncesi klorun etkisini gidermek amacıyla şişeye birkaç damla kristal sodyum tiyosülfat veya bunun %1’lik çözeltisinden 0.4-0.5 ml konulmalıdır. Bu özellikteki ular alındıktan sonra iyice çalkalanmalıdır.
Numune alırken dikkat edilecek noktalar;
1. Örnek bir musluktan alınacaksa suyun kuvvetlice 5 dakika akması sağlanır. Sonra musluk kapatılarak musluğun ağzı, bir çakmak veya bir telin ucuna sarılmış olan pamuğun alkole batırılarak yakılması ile elde edilen alevle yakılır. Alınan örnek mümkünse hemen laboratuara götürülmelidir. Sıcak havalarda bir buzluk içinde taşınması gereklidir.
2. Nehir, çay, dere gibi bir akarsudan örnek alınacaksa şişe, 0.30 m derinliğe kadar ağzı yukarı gelecek şekilde dik olarak daldırılıp, burada akıntıya ters konumda yatay çevrilerek doldurulur.
3. Kuyudan örnek alınması halinde, şişe temiz bir ip yardımıyla kuyuya indirilerek alınabileceği gibi, tulumba olması durumunda bir süre suyun akıtılmasından sonra buradan da örnek alınabilir.
4. Deniz ve gölden alınacak örnekler özel steril şişelerin takıldığı aletlerle alındığı gibi, iyice temizlenmiş nansen şişeleri ile de alınabilir. Plajlardan ve yüzme havuzlarından alınacak örnekler sabah erkenden ( plaj için 10-20 m. açıktan) alınmalıdır.
5. Biyolojik arıtma tesislerinin havalandırma havuzuna girişinden, havalandırma havuzuna girişten, havalandırma havuzundan ve çıkıştan ayrı olarak alınabilir veya amaca göre sadece çıkıştan da almak uygun olabilir. Burada dikkat edilecek nokta klorlama yapılmışsa, numune alınan şişenin tiyosülfatlı olmasıdır.
Numune alma sıklığı;
Suyun sağlık yönünden kontrolü için sık sık örnekler alınıp analiz edilmesi gereklidir.
Tüm analizlerde en az 100 mL örnek analize sokulmalıdır. Sudan örnek alma periyou nüfu sayısı dikkate alınarak belirlenebilir.
Nüfus Numune alma periyodu
20 000’den az 1 ay
20 000–50 000 2 hafta 50 000–100000 4 gün 100 000’den büyük 1 gün
Örnekler alındıktan sonra etiketlenir. Etiket aşağıdaki bilgileri içermelidir.
1. Örneğin ismi
2. Analizin yapılmasını isteyen kişi veya kuruluşun adı, ünvanı, adresi 3. Örneğin alındığı tarih
4. Kontrolün yapılmasının nedeni; rutin kontrol veya araştırma amaçlı gibi.
5. Suyun kaynağı; kuyu, nehir, göl, rezervuar, arıtma sistemi vb.
6. Suyun alındığı kısmın adı; ana boru hattı ya da dağıtım borusu gibi 7. Suyun herhangi bir işlem görüp görmediği
8. Kuyu suyu ise kuyu suyunun derinliği, kuyunun açık olup olmadığı 9. Göl veya göletten alınmışsa örneğin alındığı derinlik ve alındığı yer
10. Çevrede kirlilik oluşturacak herhangi bir yerin olup olmadığı, varsa örnek alma noktasına uzaklığı
6. PREPARAT HAZIRLANMASI
Eğer numune sıvı ise; yuvarlak öze ile 1-2 öze dolusu lam üzerine konur, film halinde yayılır.
Eğer numune katı ise iğne öze ile alınır. Lam üzerine 1 damla fizyolojik tuzlu su (F.T.S.) konur. İğne öze ile alınan numune F.T.S. içinde ezilerek lama paralel olarak film halinde yayılır.
Fizyolojik Tuzlu Suyun Hazırlanışı:
NaCl 8,75 g.
Distile su 1000 cc.
Tuz distile suya karıştırılarak eritilir ve otoklavda sterilize edilir.
Preparatın Kurutulması
Preparat amaca ve usulüne göre hazırlandıktan sonra yapılacak ikinci işlem, bunların kurutulmasıdır. Preparatlar genellikle, havagazı alevinin üstünde ve döndürülerek (dairesel ve yatay) çabuk kurumaları sağlanır. Lam alevin üstünde ve yanmayacak bir yükseklikte pensle veya parmakla tutularak kurutulur. Kurutma işlemi, ayrıca preparatlar oda veya inkübatör (etüv) ısısında bırakılmak suretiyle yapılabilir. Kurutma işlemi sırasında, lam üzerinde bulunan mikroplar hafifçe lama yapışırlar. Ancak su ile yıkandıklarında düşebilirler.
Preparatın Tespiti (Fiksasyon)
Preparatlar kurutulduktan sonra tespit edilir. Hücrelerin ve mikroorganizmaların iç ve dış yapılarının korunmasına ve sabit pozisyonda tutulmasına "Fiksasyon" denir. Fiksasyon işlemi hücre morfolojisini bozabilecek enzimleri inaktive eder ve hücre yapısını güçlendirir. Bu şekilde hücreler boyama ve gözlem esnasında değişmezler. Fiksasyon esnasında mikroorganizmalar genellikle öldürülür ve lama yapışırlar.
Tesbit başlıca iki şekilde yapılır:
1) Fiziksel tesbit: Kurutulan preparat, bir ucundan pensle tutularak alevin içinden 3 defa geçirilerek tespit edilir. Tespit sırasında preparatın yanmamasına dikkat edilir. Yanmış preparatlarda mikroorganizmalar dağılmış, şişmiş ve deforme olmuş bir şekilde görülürler. Isı ile fıksasyonda genellikle mikroorganizmaların morfolojileri korunur fakat hücre içi yapıları korunmaz.
2) Kimyasal tesbit: Hücre içi yapılar korunmak isteniyorsa, kimyasal fiksasyon kullanılmalıdır. Kimyasal fıksatifier hücreye girer ve hücre bileşenleri (genellikle protein ve lipidler) ile etkileşirler. Bu reaksiyon sonucu hücre bileşenleri aktivitesini kaybeder, çözünemez hale gelir ve hareketini kaybeder. Ethanol, asetik asit, civa klorür ve formaldehit genel olarak kullanılan fiksatifler arasındadır.
7. MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA YÖNTEMLERİ
Mikroorganizmalar renksiz ve şeffaf oldukları için mikroskopla yapılan gözlemde morfolojileri tam olarak belirlenemez. Bunun için mikroorganizmanın çeşitli boyalardan biri ile boyanması gerekir. Boyanmış olan mikroorganizma canlılığını kaybeder ve zeminle arasında oluşan renk ton farklılığı (kontrast) onun morfolojik olarak net görünmesini sağlar.
Boyama işlemi bakterinin o boya grubuna karşı reaksiyonunu belirlemek için de yapılabilir (Gram boya metodu). Ayrıca mikroorganizmanın çeşitli organellerinin (Kapsül, spor, çekirdek, flagella vb.) belirlenmesi için de değişik tip boya ve metotları da kullanılmaktadır.
Boyama mikroorganizma ve boya arasında kimyasal bir reaksiyon sonucu meydana gelir.
Boyalar genellikle iyonlardan bir tanesinin renkli olduğu tuzlardır. Tuz negatif ve pozitif yüklü iyonlardan oluşur. Renk pozitif iyon üzerinde ise bazik; negatif iyon üzerinde ise asidik olarak adlandırılır. Hücre kendisini çevreleyen ortamın nötr pH’ a sahip olduğu genellikle negatif yüklüdür. Böylece bazik boya ile boyanan hücre, negatif ve pozitif yüklü iyonların birleşmesi sonucu boyanır. Metilen mavisi, safranin ve kristal violet bazik boyalara örnek olarak verilebilir.
Asit boyaları ise negatif yüklü hücreyi boyayamayacakları için, hücre etrafında deposit oluştururlar. Bu tür boyamaya negatif veya direk olmayan boyama denir. Bu tür boyama genelde bakteriyolojide kullanılmaz. Fakat bu tür boyama ile mikroorganizmanın şekli ve büyüklüğü daha net olarak görülür. Kapsüllerin görünmesi için negatif boyama yapılır.
Bakteri çini mürekkebi veya nigrosin ile giremediklerinden dolayı, bakteriler mavimsi renkte boyanan zemine kıyasla daha açık renkte teşhis edilirler.
Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerini başlıca iki gruba ayırmak mümkündür.
1) Basit boyamalar: Bu tarz boyamada, preparatlardaki mikroorganizmalar hakkında kısa süre içinde bilgi edinmek için tek boya solüsyonu kullanılır. Boya preparata bir defa uygulanır ve bakteriler boyaların karakterine göre boyanır. Bu amaçla karbol fuksin, kristal violet ve metilen mavisi gibi bazik boya solüsyonlarından biri seçilir.
2) Bileşik boyamalar: Birden fazla boya ile yapılan boyama yöntemidir. Bunlar;
a) Diferansiyel boyamalar: Mikroorganizmaları birbirinden ayırmada kullanılır. (Gram boyama)
b) Strüktürel boyamalar: Bakterilerin iç ve dış yapılan hakkında bilgi edinmek için kullanılan bileşik boyama yöntemleridir. (Spor, kapsül, flagella, çekirdek, lipid v.s.)
8. BASİT BOYAMA METODU Deneyin Amacı:
Bakterilerin morfolojileri hakkında bilgi sahibi olmanın yanında bazı bakterilerin boyanma reaksiyonlarını belirlemek.
Bazı basit boyama yöntemleri:
1. Karbol Fuchsinle Boyama : Usulüne göre hazırlanmış, kurutulmuş ve fiske edilmiş preparatlar üzerine, karbol fuchsin solusyonu filtre kağıdından süzülerek konur ve 5 – 10 saniye boyama için bırakıldıktan sonra, boya dökülür ve hafif akan su ile yıkanır. Kurutma kağıdı ile veya havada kurutulduktan sonra, üzerine sedir yağı konarak immersiyon objektifi ile bakılır. Mikroorganizmalar kırmızı renkte görünür.
2 . Krital Viyolet ile Boyama : Hazırlanan preparat üzerine kristal viyolet solusyonundan konarak 20 – 30 saniye kadar bekletilir. Sürenin sonunda boya dökülür, preparat su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroorganizmalar mor renkte görülürler.
3. Metilen Mavisi ile Boyama : Bu amaçla Löffler metilen mavisi solusyonu kullanılır.
Preparat üzerine boya solusyonu konarak 5 – 8 dakika bekletilir. Boya dökülür, yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroplar mavi renkte görülürler.
4. Negatif Boyama : Bu tür boyama yönteminde mikroorganizmalar değil, saha boyanır.
Karanlık olan sahada mikroplar renksiz ve parlak olarak görünürler. Bu amaç için, nigrosin ve çin mürekkebi kullanılır. Lam üzerine bir damla boya ve sonra bir damla kültür konarak yayılır ve ince bir froti hazırlanır. Kuruduktan sonra muayene edilir. Bu yöntemden kapsülleri görmek için yararlanılır.
5. Spor Boyama : Safranin ile 30 saniye boyanır. Boya dökülür, saf su ile yıkanır. Kurutma kağıdı ile kurulanır. Sırasıyla olmak üzere tüm objektiflerle incelenir. İmmersiyon yağı ile immersiyon objektifinde sporlar yeşil, bakteriler kırmızıdır.
6. Mantar Boyama : Katı mantar kültüründen iğne ile numune alınır, kurutulur, tespit edilir.
Laktofenol mavisi ile 3 dakika boyanır. Dökülür, saf su ile yıkanır. Kurutulur ve immersiyon objektifinde mantarlar mor olarak gözlenir.
Deneyde kullanılan alet ve malzemeler:
- Mikroskop
- Lam, öze, boyalar, immersiyon yağı, beher, kurutma kağıdı Metilen Mavisinin Hazırlanışı: Bkz. EK 2
Deneyin Yapılışı:
- Kültür ortam sıvı ise: Sterilize edilmiş olan öze ile alınan kültür temiz bir lamın orta kısmına konarak yayılır.
- Kültür ortamı katı ise: Hazırlanan peptonlu (% 0.1) veya fizyolojik tuzlu sudan (% 0.085) temiz lam üzerine pipetle (1 ml'lik) bir damla damlatılır. Katı vasattan sterilize edilmiş iğne öze ile alınan kültür bu suda özelendirilir (Homojenize edilir).
Basit Boyama:
- Lam üzerine alınan numunenin havada kuruması sağlanır.
- Alevden geçirilerek (3 defa) fiziksel tesbit edilir,
- Eğer basit boyama yapılacaksa, kültürün yayıldığı alanı örtecek şekilde boyalardan biri (Metilen mavisi veya safranin vb) lam üzerine dökülür 2 dakika beklenir.
- Boya kaba dökülerek, lam az miktarda akan musluk suyu ile yıkanarak kurutma kağıdı ile kurulanır.
- Bir damla immersiyon yağı damlatılarak, mikroskopla incelemeye alınır (100 x).
9. GRAM BOYA METODU Genel Bilgi:
Birkaç modifikasyonu olmakla beraber Gram boyama yönteminde temel ilke Olarak, tesbit edilmiş preparatın üzerine kristal viyole boyası ve gram iyot eriyiği (lugol) uygulandıktan sonra %95’lik etil alkol ile renksizleştirme işlemi yapılır ve sonra zıt bir boya eriyiği ile (sulu fuksin veya safranın gibi) uygulanarak yöntem tamamlanır. Bakterilerin büyük bir çoğunluğu bu boyama ile gram (+) veya gram (-) olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Gram boyama yönteminde önce uygulanan kristal viyole ve mordan olarak kullanılan iyot eriyiğinin uygulanmasından sonra preparattaki boyanabilir tüm bakteriler boyayı alırlar. Mordanlar boyaların nüfuz kabiliyetini artırır ve daha iyi boyanmalarını sağlarlar.
Alkol ile yapılan renksizleştirme işleminde gram (+) bakterilere aldıkları boyayı bırakmazlar.
Gram (-)’ler ise boyayı bırakarak renksizleşirler. Bunlarda son uygulanan zıt boya (sulu fuksin vs.) ile boyanırlar. Bu suretle gram (+) bakteriler mor, gram (-)’ler zıt boya renginde (sulu fuksin ile pembe-kırmızı) boyalı olarak görünürler. Bazı bakteriler gram (+) oldukları halde eskiyen kültürlerinde gram (-) varyantlar oluştururlar. Bazıları ise gram (+) oldukları halde alkolün biraz fazlaca uygulanması ile boyalarını bırakabilirler. Bunlara gram değişken bakteriler denir.
Gram (+) mekanizması olayının bakterilerin hücre çeperi yapısına bağlı olduğu bilinmektedir. Gram (+) bakterilerin hücre duvarları gram (-)’ den farklıdır. Bunlardaki peptidoglikan katmanı daha kalındır. Bu şekilde tüm hücre çeperinin %50'si peptidoglikandan ibarettir. Ayrıca çoğunda gram (-)'lerde bulunmayan teikoik asit bulunur. Gram (-)’lerin hücre duvarında ise farklı olarak bir lipopolissakkarit katmanı vardır. Bunlarda peptidoglikan yapı incedir. Her iki grup bakteride kristal moru ve lugolun hücre duvarını geçerek hücrenin içine girdikleri, gram (+)’larda bu boyaların hücre çeperi ile zor ayrılabilen bileşikler yaptığı
Kristal viyolet ve fenol kristali porselen havanda ezilir ve etil alkol yavaşça eklenir.
Lugol solusyonunun hazırlanması:
Gram boyama yönteminde mordan olarak kullanılır.
İyot 1 g. veya İyot 5 g.
KI 2 g. veya KI 10 g.
Distile su 300 cc. veya Distile su 100 cc.
İyot ile KI havanda iyice ezilir. Sonra distile su yavaş yavaş katılır ve iyice karıştırılır. Sonra şişeye aktarılır. Kahverengi şişelerde saklanır.
Deneyin Yapılışı:
1) Sıvı ve katı kültür ortamından öze ile alınıp lam üzerine yayılan bakteri kültürünün havada kuruması sağlanır. 3 defa alevden geçirilerek fiziksel tesbit yapılır.
2) Lam ( préparât ) boya kabına konarak, kristal viyole ile 1 dakika boyanır.
3) 1 dakika sonra kristal viyole boya kabına dökülür.
4) Lam üzerinde kalan boya üzerine lugol ilavesi yapılır. 1 dakika beklenir.
5) 1 dakika sonra boya kaba dökülerek, % 95' lik Etil Alkol ve su ile boya akmayıncaya kadar yıkama İşlemi yapılır.
6) Bu işlemden sonra lam üzerine (preparat) safranin dökülerek 1/4 dakika beklenir. Boya dökülüp, lam yıkanarak kurulanır. Bir damla immersiyon yağı damlatılarak mikroskopla incelenir ( 100 x ). Objektif sahasında görülen mor renkli bakteriler Gram (+), pembe renkli olanlar ise Gram ( - ) olarak adlandırılır.
Gram boyama değerlendirme çizelgesi
İşlem Yöntem Sonuç
Gram (+) Gram (-) İlk boya Kristal viole ile 1-2 dk Mor renk Mor renk Lugol (mordan) Lugol ile 1 dk Mor renk Mor renk Renk giderme %95’lik alkol ile 20-30 sn Mor renk Renksiz
Zıt boyama Sulu fuksin ile 20-30 sn Mor renk Pembe renk (sulu fuksinin rengi)
Sonuç; gram (+)’ler ilk boya olan kristal violenin rengi olan mor renk, gram(-)’ler zıt boya olan sulu fuksinin rengi pembe renge boyanır.
10. MİKRO ORGANİZMALARIN ÜRETİLMESİ İÇİN BESİYERLERİ
Mikroorganizmaları izole etmek ve saf kültür olarak üretebilmek için birçok ortamlar geliştirilmiştir (Besiyerleri, vasatlar). Besi yerleri başlıca iki ana bölüme ayrılırlar.