3.1. Kullanılan Malzemeler, Araç Gereç ve Kimyasallar
Deneyde kullanılan kimyasallar yüksek saflıkta bulunup, Merck, Fuluka, Sigma-Aldrich, Riedel, Carlo-Erbaa gibi markalardan alınmıştır. Kömür katranı (CTP), Orcan Asfalt ve Yalıtım Ürünleri A.Ş (İstanbul) firmasından temin edilmiştir. Her çözücü HPLC saflığında olup aktif karbon ile tam saflaştırılması sağlanmıştır. Camsı karbon (GC) elektrotlar BAS marka olup MF- 2012 modelindedir. Referans elektrot olarak sulu ortamda kullanılan Ag/AgCl/KCldoy kullanılmıştır. Karşıt elektrot ise platin teldir. Dönüşümlü voltametri (CV) ve elektrokimyasal impedans spektrometrisi (EIS) karakterizasyonlarında 0,1M KCI içerisinde 2mM K3Fe(CN)6 ve K4Fe(CN)6 karışımı kullanılmıştır. Elektrotların temizlenmesinde SK1200H(ÇİN) ultrasonik banyo ve Human Power 1+ (G.KORE) marka ultrasaf su (18,2 M cm) cihazından elde edilen saf su kullanılmıştır. Elektrotların temizlenmesinde saf sudan başka isopropil alkol-asetonitril (1:1,V/V) karışımı kullanılmıştır (Kuzu-Çelik vd., 2016).
Elektrokimyasal ölçümleri Ivium CompactStat (ABD) elektroanalizör yardımıyla oda sıcaklığında üçlü elektrot sisteminden elde edilmiştir. IR ölçümleri ATR aksesuarlı Bruker Tensor 27(Almanya) infrared spektrofotometresi XPS ölçümleri için ise PHI 5000 VersaProbe (Japon/ABD), X-ışınları fotoelektron spektrofotometresi kullanılmıştır. Gerçek numune olarak piyasada bulunan 5 adet UHT, kapalı karton ambalajda satılan birer litrelik süt kullanılmıştır.
3.2. 3,8-Diaminobenzo[c]sinnolin (3,8-DABCC) Modifiye Grafen Oksit Elektrotların Hazırlanması
3,8-DABCC 2,2’-dinitrobifenilin hidrazinhidrat ile indirgenmesinden yola çıkılarak (İ.- Turan vd., 2012) Ankara Üniversitesinde sentezlenmiştir.
Grafitin elektrokimyasal parçalanmasıyla elde edilmiştir (Erkal vd., 2014). Katot ve anot olarak sırasıyla platin levha ve piristin grafit kullanılarak 100 ml saf suda 2,4 g H2S04 ve 11 mL %30’luk potasyum hidroksit kullanılarak grafitin elektrooksidasyonu yöntemiyle bir DC güç kaynağı (Yıldırım Elektronik, Ankara) +20 V da grafen oksit sentezlenmiştir. Grafen oksit HERMLE (Z36HK, Almanya) marka ultrasantrifüj yardımıyla 12 rpm 8 min. santrifüj ile çöktürülmüş ultrasaf su içerisinde birkaç defa yıkanarak santrifüj işlemi tekrar edilmiş ve 80⁰C vakum altında 8 saatte kurutularak saflaştırılmıştır.
0,2 g GO, 25 ml pH=7 olan fosfat tampon çözeltisi (PBS) içerisinde 10mM 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil]karbodiimit (EDC) ile manyetik karıştırıcı içerisinde 6 saat karıştırılarak aktive edilmiştir. Aktive edilmiş GO, santrifüj edildikten sonra ultra saf su ile yıkanarak yeniden santrifüj edilmiştir. 10 mL PBS (pH=7) içerisinde çözünmüş 1mM 3,8-DABCC çözeltisi içerisine saflaştırılan aktive edilmiş GO eklenerek 6 saat karıştırılması sağlanmıştır. 6 saat sonunda kolloidal olarak amitleşmiş polimer çözeltisi 3 defa ultra saf su ile yıkamak suretiyle santrifüj edilmiştir. 100⁰C de vakumlu fırın içerisinde 2 saat kurutulmuştur. Elde edilen polimer ürün pGO- DABCC olarak isimlendirilmiştir. Aşağıda Şekil 3.1’ de pGO-DABCC’in oluşum reaksiyon şeması verilmiştir. N N H N H N C O
GO
C O n N N NH2 H2NGO
COOH HOOC EDCGO
C C O O C NR RN O O C NR NR 3,8-DABCC pGO-DABCCŞekil 3.1. GO ile 3,8-DABCC’nin polimerleşmesiyle elde edilen pGO-DABCC’nin reaksiyon
10 mL asetonitril içerisine 100 mg pGO-DABCC eklenerek sonikatör içerisinde homojen dağılımlı kolloidal çözelti elde edilerek 75 W lık IR lambası altında sırasıyla 5, 10, 15, 20, 25 µL lik süspansiyonlar camsı karbon elektrot üzerine damlatılarak kurutulmuştur. Elektrotlar GC/ pGO-DABCC olarak isimlendirilmiştir.
3.3. pGO-DABCC ve GC/ pGO-DABCC nin Karakterizasyonu ve Elektrot Optimizasyonu
pGO-DABCC IR ve XPS ile karakterize edilmiştir. IR ölçümleri Üniversitemiz Fizik Bölümünde alınmıştır. XPS ölçümleri ise ODTÜ Merkezi Laboratuvarından elde edilmiştir. GC/pGO-DABCC nin elektrokimyasal karakterizasyonunda CV ve EIS teknikleri kullanılmıştır. Modifiye elektrotun karakterizasyonunda, 10 mL asetonitril içerisinde 100 mg GO çözeltisinden 15 µL alınarak IR lambası altında GC yüzeyine modifiye edilmiş GC/GO ve yalın GC elektrotlar da kullanılmıştır. Redoks prop olarak 2mM K3Fe(CN)6 ve K4Fe(CN)6 karışımı (0,1 M KCl içerisinde) kullanılmıştır. Aynı Redoks prop ile GC/pGO-DABCC elektrotun kararlılık çalışması yapılmıştır. 7 gün oda şartlarında bekletilen bir elektrot ile 20 defa kullanılmış başka bir elektrotun kararlılığı incelenmiştir. İmpedans ölçümlerinde frekans aralığı 0,2 Hz – 100 kHz arasında seçilmiştir. Redoks probun DC potansiyeli 20 mV olarak belirlenmiştir.
25 µg/L Pb+2 ve Cd+2 içeren 0,1 M sodyum asetat/asetikasit (NaAc/Hac) tampon çözeltisi içerisine GC/pGO-DABCC elektrot daldırılarak en uygun indirgenme potansiyelleri inkübasyon süresi, tamponun ideal pH’sı ve elektrot modifikasyonunda kullanılan pGO-DABCC süspansiyonunun ideal hacmi diferansiyel puls anodik sıyrılma voltametrisi (DPASV) ile belirlenmiştir. Katyonların indirgenme potansiyeli olarak -1,10 V/-1,40 V aralığında ölçümler alınmıştır. İnkübasyon süresi olarak 5.30 min., ideal pH nın belirlenmesi için 3,0-5,5 aralıkları kullanılmıştır. GC/pGO-DABCC nin modifikasyonunda kullanılan pGO-DABCC süspansiyonunun ideal hacminin belirlenmesi için 5, 10, 15, 20, 25 µL lik süspansiyonlar kullanılmıştır.
3.4. Kalibrasyon Ölçümleri ve Kalibrasyon Grafiği
Elektrot modifikasyonu ve katyonların optimum şartları belirlendikten sonra (süspansiyon hacmi 15 µL, inkübasyon pH sı 4,5, indirgenme potansiyeli 20 s için -1,25 V sabit potansiyel ve biriktirme süresi 20 min olan şartlar altında) 0,5-25,0 µg/L Pb+2 ve Cd+2 konsantrasyon aralığında muamele edilerek DPASV ölçümleri alınmıştır (N=5). Ölçümlerden elde edilen sonuçlar yardımıyla her bir katyon için akım konsantrasyon eğrisi, regrasyon denklemi, R2 ve geliştirilen yöntemin alt tayin sınırı (LOD, S/N=3) değerleri elde edilmiştir.
Geliştirilen yöntemin kesinlik ve doğruluğunu bulmak için 3 ve 7 µg/L Pb+2 ve Cd+2 standartları eklenerek gün içi ve günler arası (5 gün) 5 farklı bağımsız standart numune ile 5’er ölçüm alınmıştır. Bazı iyonların girişim etkisini bulmak için 25 µg/L Pb+2 ve Cd+2 içeren çözeltilere 25µg/L Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Co2+ ve Ni2+ ayrı ayrı eklenerek girişim etkileri incelenmiştir (Analit katyonlara göre kütle oranı 300 kat oluncaya kadar).
Gerçek numune analizleri için piyasada satılan ticari süt numunelerinden temin edilmiştir. 20g süt numunesi üzerine 50 µL H2O2 (%30 luk) eklenerek ultrasonik banyo içerisinde 20 min. sonike edilmiştir. Sonra karışım üzerine 2,5 mL HCl (%37) ve 2,5 mL asetikasit (%50) eklenerek 10 dakika daha sonike edilmiştir. Karışım 10.000 rpm de 20 min. santrifüj edildikten sonra elde edilen süpernatant 200 nm’lik mikroporöz membran ile süzülerek NaAc/HAc ile pH’sı 4,5 olarak ayarlanmıştır. Her bir numuneye 5 ve 10 µg/kg lık Pb+2 ve Cd+2 standartları eklenerek DPASV ölçümleri alınmıştır. Bu sonuçlar ekstrakte edilmiş çözelti konsantrasyonuna ait olup numune konsantrasyonu aşağıdaki eşitlikten hesaplanmıştır (Ping vd., 2014).
Cnumune(μg kg−1) = Cekstrakteçözelti (μg L−1) × 80 mL / 40 g (3.1) Ankara Üniversitesi bünyesindeki YEBİM laboratuarlarında aynı numuneler ve standart eklenmiş numuneler için ICP-OES ölçümleri alınarak her iki yöntemin sonuçlarının geri kazanım değerleri hesaplanmıştır.