Antioxidantes que atuam aumentando a resistência ao estresse oxidativo através da indução da transcrição de proteínas citoprotetoras exercem ação antioxidante indireta. No nosso trabalho, o aumento da resistência ao estresse oxidativo mediado pelo EAA também foi indiretamente dependente de DAF-16 e da via de sinalização ativada em resposta ao estresse osmótico OSR-1/UNC- 43/SEK-1. Nós demonstramos que o tratamento com EAA também aumentou a resistência ao estresse osmótico agudo em C. elegans. Esta resposta protetora pode ser explicada não só pela propriedade de remoção de radicais livres do EAA, mas também por um mecanismo indireto através da ativação de vias de sinalização de detoxificação em resposta ao estresse.
O fator de transcrição DAF-16/FOXO é regulado pela via de sinalização da insulina e é considerado um regulador chave de muitos processos biológicos importantes, incluindo a longevidade, metabolismo e resposta ao estresse (MUKHOPADHYAY; OH; TISSENBAUM, 2006).
A translocação nuclear de DAF-16 e a ativação da expressão de sod-3 foram relatados para diferentes extratos e compostos polifenólicos, como extrato de “cranberry” (GUHA et al., 2012) e Dioscorea fermentada por
Monascus (SHI et al., 2012), a quercetina (KAMPKOTTER et al., 2008),
miricetina e kaempferol (GRUNZ et al., 2012). Nossos resultados mostraram que o tratamento com EAA não aumenta a resistência ao estresse oxidativo em animais mutantes daf-16(mu86), sugerindo que o tratamento com EAA protege contra o estresse oxidativo de maneira dependente de DAF-16. No entanto, o tratamento com EAA não aumenta a localização nuclear de DAF-16 ou a expressão de sod-3 sob condições normais. Desta forma, nós sugerimos que o EAA possa interagir com DAF-16 e aumentar sua atividade, mas não sua concentração no núcleo, uma vez que DAF-16 é necessária para a proteção contra o estresse oxidativo mediada pelo EAA, mas este não aumenta a sua localização nuclear. Além disso, a ativação de DAF-16 pelo EAA no núcleo pode regular subconjuntos específicos de genes além de sod-3. Nós
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observamos que o tratamento com EAA aumentou a expressão de ctl-1 e gst-7 de maneira dependente de DAF-16.
Recentemente, Tao et al. (2013) demonstraram em C. elegans, que DAF-16 é fosforilada e ativada por UNC-43/CaMKII em uma serina na posição 286. Outra proteína, TAX-6/Calcineurina remove este mesmo grupo fosfato. Desta forma, UNC-43 e TAX-6 regulam DAF-16 através da fosforilação reversível da proteína. Este mecanismo regulatório tem modo de ação diferente da via de sinalização da insulina, uma vez que é requerido para ativação e não para a inibição de DAF-16. A ativação de DAF-16 por UNC-43 ocorre em resposta a diferentes sinais de estresse, como estresse térmico, oxidativo e escassez de alimentos. Eles observaram que UNC-43 e TAX-6 regulam DAF- 16 independentemente da via de sinalização da insulina e estes dois mecanismos parecem se coordenar para atuar sobre DAF-16. Finalmente, os autores demonstraram que a regulação de FOXO por CaMKII e Calcineurina é conservada em mamíferos.
OSR-1 é uma proteína que regula a sobrevivência do C. elegans em ambientes hiperosmóticos (SOLOMON et al., 2004). OSR- 1 atua conjuntamente com SEK-1/MAPKK através de UNC-43/CaMKII para promover a resistência ao estresse osmótico crônico. A dependência de UNC-43 para o aumento da sobrevivência em C.elegans foi demonstrada pelo tratamento com polifenóis do mirtilo (WILSON et al., 2006), “cranberry” (GUHA et al., 2012) e quercetina (PIETSCH et al., 2009). No entanto, o efeito pró-longevidade induzido por estes fitoquímicos depende de forma diferente das quinases OSR- 1 e SEK-1. Por exemplo, SEK-1, mas não OSR-1, é necessária para o aumento da longevidade promovido pela quercetina (PIETSCH et al., 2009), enquanto que OSR-1, mas não SEK-1, é necessária para o efeito pró-longevidade do “cranberry” (GUHA et al., 2012). Nosso estudo genético indica que OSR-1 é necessária para o aumento da resistência ao estresse oxidativo mediado pelo EAA, bem como UNC- 43 e SEK -1. Wilson et al. (2006) verificaram que o aumento da longevidade induzido pelo tratamento com polifenóis do mirtilo é dependente da via OSR-1/UNC-43/SEK-1. Estes resultados sugerem que a via de sinalização OSR-1/UNC-43/SEK-1 é um alvo chave para antocianinas, os polifenóis predominantes presentes no açaí e mirtilo.
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GUHA et al. (2012) observaram que o tratamento com CBE diminui a resistência ao estresse osmótico em C. elegans. Os autores explicam esta susceptibilidade ao estresse osmótico por uma depressão da via de sinalização CaMKII/p38 MAPK mediada pelo tratamento com CBE, com base na observação de que os níveis do RNAm de osr-1 são regulados positivamente pelo tratamento com CBE. Uma regulação positiva de osr-1 mediada por flavonóides da cebola também foi demonstrada por Xue et al. (2011).
Em nosso estudo, nós demonstramos que o tratamento com EAA aumentou a resistência ao estresse osmótico agudo em C. elegans. A perda de função da proteína OSR-1 ativa constitutivamente GPDH-1 e o acúmulo de glicerol (WHEELER; THOMAS, 2006). O glicerol, por sua vez, substitui íons inorgânicos no citoplasma e funciona como uma chaperonina química que ajuda no enovelamento de proteínas danificadas. Este efeito diminui o dano proteico sob condições de estresse osmótico (LAMITINA et al., 2006). A princípio, nossa hipotése seria de que o EAA pudesse estar diminuindo os níveis de RNAm de osr-1 e consequentemente aumentando a síntese de glicerol na célula. No entanto, o tratamento com EAA não modificou a expressão gênica de osr-1 em condições normais e ainda reduziu a expressão de gpdh::GFP. Estes resultados não suportam a nossa hipótese de que o mecanismo de aumento da resistência ao estresse osmótico mediado pelo EAA envolva a regulação negativa de OSR-1 e o aumento da síntese de glicerol.
Como a resistência ao estresse oxidativo mediada pelo tratamento com EAA foi dependente de OSR-1, nossa hipótese é de que o açaí pode atuar diretamente, bloqueando a atividade da proteína OSR-1 ou mesmo inibindo proteínas acessórias. A inibição de OSR-1 pelo EAA por sua vez ativa UNC-43 e SEK-1 e, consequentemente, promove a resistência ao estresse oxidativo. 6.4 Análise da sobrevivência do C. elegans tratado com EAA sob condições normais
Notavelmente, o efeito pró-longevidade é uma característica comum observada em C. elegans submetidos à intervenções com fitoquímicos, tais como miricetina, CBE, quercetina e polifenóis do mirtilo (BUCHTER et al, 2013; GUHA et al, 2012; KAMPKOTTER et al, 2008; WILSON et al, 2006).O tratamento com EAA aumentou a resistência sob condições de estresse. No
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entanto, ele não apresentou um efeito pró-longevidade, uma vez que não aumentou a sobrevivência do C.elegans sob condições normais. Esta ausência de correlação entre a capacidade antioxidante in vitro e o aumento da longevidade em C. elegans foi observada por Pun et al. (2009), onde os extratos das espécies Cortex magnoliae officinalis (casca), Curculigo orchioides
Gaertn (rizoma), Glycyrrhiza uralensis Fisch (casca), Psoralea corylifolia L.
(fruta), Cratoxylum cochinchinense (folhas), e casca de pinheiro não aumentaram a longevidade dos animais.