Daldırmalı Fermantasyon Yöntemi

Ticari enzimlerin çoğunun üretiminde daldırmalı fermantasyon tercih edilmektedir. Bu sistemlerde prosesin kontrolü ve sterilizasyonu mühendislik açısından daha kolaydır. Daldırmalı fermantasyon sıvı ortamda çözünmüş yada katı süspansiyon halinde nütriyentleri kullanarak süspanse haldeki mikroorganizmaların gelişmesiyle oluşur. Daldırmalı fermantasyon için bir çok reaktör sistemi vardır.

1) Karıştırıcılı tank reaktör (Stirred-tank reactor): En çok kullanılan reaktörlerdir. Besi oartamını karıştıran bir karıştırıcıya (impeller) sahiptirler.

2) Kabarcıklı kolon reaktörler (Bubble column): Hava, uygun dağılımı sağlamak için bir yeterli çalkalamayı sağlayan alt sparger’dan gönderilir.

3) Hava köprülü reaktörler (Airlift): Besi ortamı uzun bir tüpün içine yerleştirilen iki kolon civarında karıştırılır. Giren hava besiyerini iç taraftaki kolonun (yükseltici) yukarısına çıkarır ve ondan sonra da dış kolonun (alt tüp)aşağısına indirir.

4)Yataklı reaktörler (Packed bed): Katı bir yapı ile doldurulan kolon mikroorganizmaları bu yapının içinde sıkıştırır.

Fermantasyon kesikli, yarı kesikli ve sürekli yöntemlerden biriyle yapılabilir. Kesikli fermantasyonda başlangıçta gerekli olan tüm bileşenler (nütriyentler ve hücreler) fermentöre konur. Fermantasyon ortamında büyüme ilerledikçe nütrientler harcanır, mikrobiyal kütle ve ürünler artar.

Fermantasyon ortamında enzim üretimi, şartların kötüleşmesinden önce enzim verimi ve aktivitesi maksimum bir seviyededir.

Fermantasyon ortamının doğrudan veya dolaylı olarak takip edilmesinde kullanılan başlıca parametreler Şekil 6.2.’de verilmiştir. Enzim üretimi bazı durumlarda biokütlenin

Şekil 6.2. (a.b.c) Fermantasyon ortamındaki mikroorganizma, substrat ve enzim üretiminin zamanla

değişimi.

gelişmesiyle birlikte olur (Şekil 6.2.a). Bu durum için Aspergillus niger’den glukoksidaz üretimi Şekil 6.2.b’de görüldüğü gibi bazı enzimler hücre büyümesi tamamlandıktan sonra üretilir. Bu türe tipik bir örnek Trichoderma reesci’den selülaz üretimidir. Enzim fermantasyonlarının çoğunda enzim aktivitesi birkaç saat süren bir zaman aralığında maksimum bir değerde seyreder. Daha sonra büyümeye karşı inhibitör veya toksik etki gösteren ürünlerin oluşmasından yada bazı esansiyel nütriyentlerin tükenmesinden dolayı enzimin inaktivasyonu gözlenir. Bu gibi durumlarda enzim aktivitesinin zamanla değişimi takip edildiğinde bir pik gözlenir (Şekil 6.2.c). Burada ürünün ortamdan alınması için kriter fermantasyonun maksimum enzim aktivitesine ulaşıp ulaşmadığının belirlenmesidir. Hatta diğer iki durumda da (Şekil 6.2.a,b) enzim uzun süre fermantasyon ortamında kaldığında ortamda meydana gelen değişimler sonucu aktivitenin azaldığı gözlenir. Fermantasyon tamamlanması genellikle çözünmüş oksijen, pH ve CO2 çıktılarındaki değişmelerle gözlenebilir. Tipik bir enzim üretimi proses şartlarına bağlı

olarak 18-180 saat arasında değişebilir. Bu süre sonunda fermantör ortamı çeşitli ayırma yöntemleriyle ayrılır. Üretilen enzim hücre içi enzim ise biokütle, hücre dışı enzim ise kültür sıvısı alınarak ürün kazanımı amacıyla alt akım işlemleri uygulanır.

Kesikli fermantasyon ticari çoğu enzimlerin üretiminde tercih edilen bir metot olarak yaygın bir şekilde kullanılır. Bununla birlikte substrat tarafından katabolit represyon meydana geldiği zaman sınırlı karbon koşullarında çalışabilmek için alternatif olarak yarı kesikli fermantasyon kullanılabilir. Bu yöntem enzim sentezi represyonunu engeller. Bu tür proseslerin esas özeliği, daha aktif enzim üretim periyodunu uzatmak için ilave nütriyentlerin fermantasyon ortamına beslenmesidir.

Alternatif bir operasyon şekli sürekli proseslerdir. Burada sürekli olarak reaktöre steril taze nütrient beslenirken aynı zamanda ortamdan eşit hacimde ürün çekilir. Bu yöntemle fermantasyon çok uzun süre kararlı halde çalıştırılır. Fermantörü terk eden biokütle ile hücre büyümesi dengededir. Sürekli fermantasyon sisteminin en yaygın kullanılan tipi kemostattır. Besi ortamına mikroorganizma üremesi için gerekli olan temel besinlerden (üremeyi sınırlandıran) birinin fazlası, ötekilerin ise yeterli miktarları sürekli olarak gönderilerek giriş ve çıkış debileri ayarlanır. Bu koşullar altında kararlı halde kültürün spesifik büyüme hızı (µ), seyrelme oranı olarak adlandırılan besleme hacminin (Q) kültür hacmine (V) oranı yardımı ile belirlenir. Fermantördeki biokütle konsantrasyonu besleme ortamındaki sınırlayıcı komponentin konsantrasyonu ayarlanarak sürekli sabit tutulabilmektedir (Pekin,1980). Sürekli kültür, klasik kesikli fermantasyon kültüründen daha yüksek verimlilik ve spesifik nutriyentin sınırlandırılmasıyla represyon mekanizmalarının etkilerini hafifletebilmesine rağmen, ticari enzim üretimi proseslerinde oldukça sınırlı olarak kullanılmaktadır. Bunun sebebini dört başlık altında incelenebilir.

a) Sürekli proseslerin uzun sürelerinden dolayı ürünlerin kontaminasyon riski vardır. b) Mutasyona uğrayan mikroorganizmalrın sürekli üretim esnasında ilk yapılarına dönerek

ürün kalitesini ve üretim hızını azaltabilir.

c) Sürekli proseslerde çoğu hücre dışı enzim üretim verimi kesikli sistemlerden daha azdır. Sürekli sistemler daha kompleks kontrol sistemleri ve teçhizat gerektirmesine rağmen toplam verimlilik daha fazla artırılamamaktadır.

d) Ticari enzim üretim proseslerinde yaygın olarak kullanılan, kompleks ortamda büyümeyi sınırlayan nutriyentin yapısının kesin olarak belirlenebilmesindeki güçlüklerdir.

6.2.4.2.1. Daldırmalı Fermantasyonda Enzim Üretimi Üzerine Ortam Şartlarının Etkisi Đşletim sistemine bakılmaksızın (kesikli, yarı kesikli yada sürekli) havalandırma hızı, karıştırma hızı, çözünmüş oksijen, pH ve kültür sıcaklığı enzim fermantasyonunu etkileyebilen faktörlerdir.

● pH: Her mikroorganizmanın özgün bir iç pH değeri vardır ve hücreler yaşamları süresince bu pH değerini sabit tutmaya çalışırlar. Ortamdaki hidrojen iyonu derişimi hücrenin metabolik faaliyetlerine bağlı olarak değişir ve hücre dışındaki değişimlere rağmen hücre, iç pH değerini sabit tutar. Ortam pH’sına bağlı olarak hücre içi tepkimeler ve hızları değiştiğinden biyoteknolojik ürünlerin üretiminde kullanılan mikroorganizmalar, çoğalma ve istenen ürünün üretimi için farklı optimum pH değerine ya da aralığına sahip olabilirler. Ayrıca biyoproses süresince pH, kullanılan karbon kaynaklarının farklı ürünlere dönüşmesiyle değişme eğilimindedir. Karbonhidratlar (örneğin glikoz) hücre içi tepkimelerle oluşan organik ve amino asitlerin ortama salgılanmasıyla birlikte ortam pH’sında önce düşme ortama salgılanan metabolitlerin tekrar hücreye transferi ve kullanımıyla sonra da artış gözlenir. Sonuç olarak biyoüretim sürecinde verim ve seçimlilik açısından dış ortamın pH’sını belli değerde ya da aralıkta tutmak gerekebilir (Pekin, 1980).

● Sıcaklık: Mikroorganizmalar genel olarak üç gruba ayrılabilirler. 20 °C veya daha düşük sıcaklıklarda optimum büyüme gösteren psikrofiller, 35 °C civarında optimum gösteren mezofiller, büyüme sıcaklığı 50 °C’den fazla olan termofillerdir. Her bir sınıf içinde optimum değere doğru sıcaklık artarken spesifik büyüme hızı Arhenius eşitliğindeki (µ=Ae-E/RT) gibidir. Her mikroorganizmanın maksimum büyümeye ulaştığı bir sıcaklık aralığı vardır. Ancak optimum değerin ötesinde sıcaklık daha fazla artmasına rağmen, büyüme hızlı bir şekilde azalmaktadır. Büyüme zamanlarını minimize etmek için kültür sıcaklığı mümkün olduğunca optimum sıcaklığa yakın olmalıdır.

Biyodönüşüm ortam sıcaklığı, mikroorganizma çoğalma hızını olduğu gibi karbon ve enerji kaynaklarının kullanım hızını ve ürün oluşum verimliliğini de etkiler. Her biyoproses için mikroorganizmanın çoğalmasının ürün oluşumunun maksimum olduğu bir sıcaklık veya sıcaklık aralığı vardır.

● Çözünmüş Oksijen Aktarımı: Aerobik proseslerde mikrobiyal hücreler solunum, çoğalma, substrat tüketimi ve ürün sentezi gibi metabolik faaliyetlerini sürdürebilmek için gerekli olan temel girdilerden biri oksijendir. Bu nedenle biyoproses ortamındaki çözünmüş oksijen derişimi ve oksijenin aktarım hızı önemlidir. Oksijen aktarımı, ürün verimi ve seçimliliğini etkiler. Bir biyoprosesde oksijen gereksinimi ve aktarım hızı, mikroorganizma türüyle, biyodönüşüm ortamının fiziksel özelliği ile biyoreaktör ve karıştırıcı konfigürasyonuyla ilgilidir. Karıştırmalı biyoreaktörlerde oksijen / hava giriş hızı ve karıştırma hızı önemli işletim parametrelerindendir.

Çözünmüş oksijenin metabolizmaya yeterli hızda aktarılıp aktarılmadığının bilinmesi, oksijen transfer katsayısı (kLa) belirlenmesi ile mümkündür. kLa, mikroorganizma türüne, biyo

karıştırma ve havalandırma hızlarına bağlıdır (Aiba vd., 1973). kLa’nın belirlenmesi için çeşitli

deneysel ölçüm yöntemleri geliştirilmiştir (Wang vd., 1979). Bunlardan en yaygın olarak kullanılanı dinamik yöntemdir. Kolay uygulanabilir olması ve gaz içerisindeki bileşenlerin analizine ihtiyaç duyulmaması yöntemin avantajları arasındadır (Van’t Riet, 1983). Yöntem biyoreaktöre gönderilen havanın kısa süreli olarak kesilmesi ve bir oksijen elektrodu ile çözünmüş oksijen derişiminde ki azalmanın, havanın tekrar sisteme verilmesi ile de artışın incelenmesi prensibine dayanır (Rainer, 1990).

Yatışkın olmayan durumda fermantasyon sırasındaki çözünmüş oksijen derişiminin zamanla değişimi aşağıdaki gibidir.

(6.1)

Zamanla oksijen derişimi değişimi Şekil 6.3’deki gibi karakterize edilmektedir. Havanın kesildiği to anına kadar biyoreaktörde çözünmüş oksijen derişimi yatışkın koşulda C

gibi bir değerdedir ve t1 anında hava yeniden verilmektedir. to anından t1 anına kadar

zamanla çözünmüş oksijen derişimindeki azalma gözlenir. Burada oksijen aktarımı gerçekleşmediğinden kLa(C -C₀)

*

0 terimi sıfıra eşittir ve eşitlik (6.1), eşitlik (6.2)’ye

indirgenir. (6.2) C r r ' _x o 0 =

Şekil 6.3. Çözünmüş oksijen derişimin kalma süresi ile değişimi.

I II III Hava verilir Hava kesilir Zaman C C0 t0 t1 C0 dt dC C ' r ) C C ( k o x o o * o La − + =

r

dt

dC

₌

Şekil 6.4. Sıvı faz kütle transfer katsayısı

Eşitlik (6.2)’den oksijen tüketim hızı r0 bulunabilir. t1 anında hava gönderilmesi ile

çözünmüş oksijen derişiminin zamanla artışı gözlenmektedir. Bu durumda eşitlik (6.1) geçerlidir. Eşitlik (6.1) ve (6.2)’den yararlanarak {(dCo/dt-ro);Co} grafiği elde edilir (Şekil 6.4).

Bu grafiğin eğiminden kLa elde edilir.