Clusterin rs11136000 C/T tek nükleotit polimorfizminin genotiplemes

Clusterin rs11136000 C/T SNP bölgesinin çoğaltılması için kullanılan primer dizisi Gu ve arkadaşlarının (2011) yayınından alınmış ve Primer-Blast programından kontrol edilmiştir (Tablo 2.1). Clusterin rs11136000 C/T SNP bölgesini çoğaltmak için kullanılan primerlerin bağlandığı nükleotitler ve restriksiyon enziminin tanıdığı nükleotitler Şekil 2.2’de gösterilmiştir.

PCR reaksiyon koşullarında ve programında tek ve istenen bandın elde edilmesi için çeşitli denemeler yapılarak bu aşama optimize edilmiştir. İki farklı MgCl2

konsantrasyonu (1.50 mM – 2.00 mM) ve üç farklı kalıp DNA konsantrasyonu (400 ng – 300 ng – 200 ng) denenerek PCR karışımı koşulları optimize edilmiştir. Ayrıca Tablo 2.5’teki döngü programıyla ilgili de pek çok deneme yapılmıştır. Bunlar; primer bağlanma sıcaklığı (annealing temperature) olarak 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60 ve 61°C denenmesi, sentez süresi olarak 50 saniye ve 30 saniye denenmesi ve döngü sayısı olarak 35 ve 40 döngü denenmesidir.

Şekil 2.2: Clusterin geninin rs11136000 C/T tek nükleotit polimorfizmini içeren bölgesinin sekansı. İleri ve geri primerlerin tanıdığı bölgeler mavi renkli kutucuğun içinde, ApoI restriksiyon enziminin tanıdığı ve kestiği bölge kırmızı renkli kutucuğun içinde ve polimorfik nükleotit ise kırmızı renkli olarak belirtilmiştir (Sekans URL-10 kaynağından alınmıştır).

Clusterin rs11136000 C/T SNP bölgesi için optimize edilmiş PCR karışımı bileşenleri Tablo 2.4’te verilmiştir. PCR karışımı için (toplam hacim 50 µL) 2.0 mM MgCl2, 200

μM dNTP karışımı, 400 nM ileri ve geri primer, 200 ng genomik DNA ve 1.25 ünite Taq DNA polimeraz kullanılmıştır (Tablo 2.4).

Tablo 2.4: Clusterin rs11136000 C/T SNP bölgesini çoğaltmak için kullanılan PCR karışımı içeriği. İçerik 1 tüp için eklenen hacim Stok konsantrasyonu 50 µL reaksiyon karışımındaki son konsantrasyon Steril apirojen H2O 50 µL’ye tamamlayacak kadar Amplifikasyon tamponu 5 µL 10X 1X MgCl2 4 µL 25 mM 2.0 mM dNTP karışımı 1 µL 10 mM 200 µM

İleri primer 2 µL 10 pmol/µL 20 pmol (400 nM)

Geri primer 2 µL 10 pmol/µL 20 pmol (400 nM)

Kalıp DNA değişken değişken 200 ng

Clusterin rs11136000 C/T SNP bölgesinin amplifikasyonu için kullanılan optimize edilmiş ısıl döngü (thermal cycling) programı Tablo 2.5’te verilmiştir.

Tablo 2.5: Clusterin rs11136000 C/T SNP bölgesini çoğaltmak için kullanılan PCR programı.

PCR sonucunda elde edilen DNA’lar agaroz jel elektroforezi yöntemi ile incelenmiştir. Bu amaçla, elde edilmesi planlanan PCR bandının büyüklüğünün görülmesini sağlayacak yoğunlukta bir agaroz jel (%2) hazırlanır. Jel bölüm 2.2.1.4’te anlatıldığı gibi ve %2’lik olacak şekilde hazırlanmıştır. PCR ürünlerinin öngörülen büyüklüğü Tablo 2.3’te verildiği gibi 246 bç (baz çifti)’dir. 12 µL PCR ürünü 2 µL bromofenol mavisi ve xylene cyanol FF içeren bir yükleme tamponu ile karıştırılarak jele yüklenir. Aynı zamanda 50-1000 bç arasında bantlar veren bir DNA belirteci (50 bç’lik DNA ladder) de jele yüklenir, böylelikle elde edilen bandın büyüklüğü tahmin edilebilir. Bunun için 3 µL DNA belirteci 2 µL yükleme tamponu ile karıştırılarak bir kuyucuğa yüklenir. Jel ~1 saat 120 voltta yürütülür ve UV ışığı altında görüntüsü alınır.

Clusterin rs11136000 C/T SNP için PCR ürünlerinin restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesilmesi

Clusterin rs11136000 C/T genotipleri, ApoI restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilip, kesim ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonucunda gözlenen bantlarının büyüklüğüne göre belirlenmiştir. ApoI enziminin tanıma bölgesi aşağıdaki gibidir ve bu dizide geçen R, A (adenin) veya G (guanin) nükleotitini temsil ederken, Y ise C (sitozin) veya T (timin) nükleotitini temsil etmektedir (URL-16).

Clusterin rs11136000 C/T genetik polimorfizminin genotiplerinin belirlenmesi şematik olarak Şekil 2.3’te açıklanmıştır. Clusterin rs11136000 C/T genetik polimorfizmini belirlemek için üretilen PCR ürününde ApoI enziminin tanıma bölgesi

İlk denatürasyon 94°C 3 dk. Denatürasyon 95°C 30 sn. Primer bağlanması 60°C 20 sn. Sentez 72°C 50 sn. Son uzama 72°C 10 dk 40 döngü

varsa, PCR ürünü ApoI ile inkübe edildiğinde 246 bç’lik PCR ürününün 131 bç ve 115 bç’lik iki parçaya ayrılması beklenir. Agaroz jel elektroforezinde yürütülmüş olan restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilmiş PCR ürünü, 131 bç ve 115 bç boyutlarında iki ayrı bant şeklinde görünmekte ise bu durumda bu PCR ürününün elde edildiği DNA örneğinin alındığı bireyin clusterin rs11136000 C/T genotipinin TT (polimorfik homozigot genotip) olduğuna karar verilir. PCR ürününde ApoI enziminin tanıdığı nükleotit dizisi bulunmadığı takdirde, 246 bç’lik PCR ürünü kesilmeyip, agaroz jel elektroforezinde, kontrol amacıyla jele yüklenmiş (ApoI restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilmemiş) 246 bç boyutundaki PCR örneğiyle aynı büyüklükte bir bant olarak görünmektedir. Bu durumda bu bireyin genotipinin CC (yabanıl homozigot genotip) olduğuna karar verilir. Heterozigot (CT) olan bireylerden elde edilmiş PCR örneklerinden bazılarında ApoI enziminin kesim bölgesi varken, bazılarında ise bu kesim bölgesi bulunmamaktadır. Bu yüzden ApoI enzimiyle muamele edilmiş PCR ürünü jele yüklendiğinde 246 bç, 131 bç ve 115 bç boyutlarında üç bant elde edilir.

Şekil 2.3: Clusterin rs11136000 C/T tek nükleotit polimorfizmine ait genotiplerin belirlenmesi ve şematik agaroz jel elektroforez görüntüsü.

Kullanılan ApoI enzimi fast-digest bir enzimdir ve inkübasyon süresi 15 dakika olarak önerilmektedir. Ancak yaptığımız optimizasyon çalışmaları sonucunda clusterin rs11136000 C/T bölgesinin ApoI restriksiyon endonükleaz enzimiyle kesilmesinde en iyi sonuçların PCR ürününün ApoI enzimiyle 40 dakika boyunca 50°C’de inkübe

edilmesi ile elde edildiği belirlenmiştir. Ayrıca 20 µL PCR ürününün tam olarak kesilmesi için gereken ApoI enzim miktarı da optimize edilmiş ve 20 ünite (U) enzimin en iyi sonucu verdiği görülmüştür (Tablo 2.6).

Bu yöntemde öncelikle clusterin rs11136000 C/T SNP için elde edilen 246 bç uzunluğundaki PCR ürünlerinin 20 µL’si 20 U ApoI enzimi ile 50°C’de 40 dakika inkübe edilir (Tablo 2.6), inkübasyondan sonra kesim ürünleri %2.5’lik agaroz jelde analiz edilir. 246 bç’lik PCR ürünü TT polimorfik homozigot genotipi için 131 ve 115 bç’lik iki bant verirken, CC yabanıl homozigot genotipi kesilmemiş 246 bç’lik tek bant verir (Şekil 2.3).

Tablo 2.6: Clusterin rs11136000 C/T SNP bölgesi için restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesim karışım içeriği.

İçerik 1 tüp için eklenen hacim Stok konsantrasyonu 30 µL reaksiyon karışımındaki son konsantrasyon Steril apirojen H2O 5 µL --- --- NEB buffer 3.1 3 µL 10 X 1 X Apo I 2 µL 10000 U/mL 20 U PCR ürünü 20 µL --- ---

Bu polimorfizm için RFLP yönteminin genotipleri doğru belirleyip belirlemediğini test etmek amacıyla genotipi PCR-RFLP ve agaroz jel elektroforezi yöntemi ile belirlenmiş olan, homozigot yabanıl tip (CC) ve homozigot polimorfik genotipe (TT) sahip iki bireyin PCR ürünü seçilerek sekanslamaya yollanmıştır. Sekanslama işlemi ABI 310 DNA dizi analizi cihazında Ref-Gen firmasından hizmet alımı ile gerçekleştirilmiştir. Şekil 2.4’te sunulan sekansa göre RFLP ile homozigot yabanıl tip (CC) genotipe sahip olduğuna karar verilen bireyin DNA’sından elde edilen PCR ürününde beklenildiği gibi ApoI için kesim bölgesi olarak tanınmayan AAACTC dizisi görülmüştür. Şekil 2.5’te sunulan sekansa göre ise RFLP ile homozigot polimorfik genotipe (TT) sahip olduğuna karar verilen bireyin DNA’sından elde edilen PCR ürününde beklenildiği gibi ApoI için kesim bölgesi olarak tanınan AAATTC dizisi görülmüştür. Bu sonuçlara göre PCR-RFLP yöntemi ile karar verilen genotiplerin doğruluğu teyit edilmiştir.

Şekil 2.4: Clusterin rs11136000 C/T SNP için PCR-RFLP yöntemi ile homozigot yabanıl tip (CC) genotipe sahip olduğuna karar verilen bireyin DNA’sından elde edilen PCR ürününün sekans görüntüsü.

Şekil 2.5: Clusterin rs11136000 C/T SNP için PCR-RFLP yöntemi ile homozigot polimorfik (TT) genotipe sahip olduğuna karar verilen bireyin DNA’sından elde edilen PCR ürününün sekans görüntüsü.

2.2.2.2 Clusterin rs3087554 A/G tek nükleotit polimorfizminin genotiplemesi