Clusterin rs3087554 A/G tek nükleotit polimorfizminin genotiplemes

Clusterin rs3087554 A/G SNP bölgesinin çoğaltılması için kullanılan primer dizisi Primer-Blast programı kullanılarak dizayn edilmiştir (Tablo 2.1). Clusterinrs3087554 A/G SNP bölgesini çoğaltmak için kullanılan primerlerin bağlandığı nükleotitler ve restriksiyon enziminin tanıdığı nükleotitler Şekil 2.6’da gösterilmiştir.

Şekil 2.6: Clusterin geninin rs3087554 A/G tek nükleotit polimorfizmini içeren bölgesinin sekansı. İleri ve geri primerlerin tanıdığı bölgeler mavi renkli kutucuğun içinde, AciI restriksiyon enziminin tanıdığı ve kestiği bölge kırmızı renkli kutucuğun içinde ve polimorfik nükleotit ise kırmızı renkli olarak belirtilmiştir (Sekans URL-11 kaynağından alınmıştır).

PCR reaksiyon koşullarında ve programında tek ve istenen bandın elde edilmesi için çeşitli denemeler yapılarak bu aşama optimize edilmiştir. İki farklı MgCl2

konsantrasyonu (1.50 mM – 2.00 mM) denenerek PCR karışımı koşulları optimize edilmiştir. Ayrıca Tablo 2.8’deki döngü programında primer bağlanma sıcaklığı olarak 56, 58, 59 ve 60°C denemesi yapılmış ve döngü programı optimize edilmiştir.

Clusterin rs3087554 A/G SNP bölgesi için optimize edilmiş PCR karışımı bileşenleri Tablo 2.7’de verilmiştir. PCR karışımı için (toplam hacim 50 µL) 1.5 mM MgCl2, 200

μM dNTP karışımı, 400 nM ileri ve geri primer, 200 ng genomik DNA ve 1.25 ünite Taq DNA polimeraz kullanılmıştır (Tablo 2.7).

Clusterin rs3087554 A/G SNP bölgesinin amplifikasyonu için kullanılan optimize edilmiş ısıl döngü (thermal cycling) programı Tablo 2.8’de verilmiştir.

PCR sonucunda elde edilen DNA’lar agaroz jel elektroforezi yöntemi ile incelenmiştir. Jel bölüm 2.2.1.4’te anlatıldığı gibi ve %2’lik olacak şekilde hazırlanmıştır. PCR ürünlerinin öngörülen büyüklüğü Tablo 2.3’te verildiği gibi 335 bç (baz çifti)’dir. 12 µL PCR ürünü 2 µL yükleme tamponu ile karıştırılarak jele yüklenir. Aynı zamanda 3

µL 50 bç’lik DNA belirteci 2 µL yükleme tamponu ile karıştırılarak bir kuyucuğa yüklenir. Jel ~1 saat 120 voltta yürütülür ve UV ışığı altında görüntüsü alınır.

Tablo 2.7: Clusterin rs3087554 A/G SNP bölgesini çoğaltmak için kullanılan PCR karışımı içeriği. İçerik 1 tüp için eklenen hacim Stok konsantrasyonu 50 µL reaksiyon karışımındaki son konsantrasyon Steril apirojen H2O 50 µL’ye tamamlayacak kadar Amplifikasyon tamponu 5 µL 10X 1X MgCl2 3 µL 25 mM 1.5 mM dNTP karışımı 1 µL 10 mM 200 µM

İleri primer 2 µL 10 pmol/µL 20 pmol (400 nM)

Geri primer 2 µL 10 pmol/µL 20 pmol (400 nM)

Kalıp DNA değişken değişken 200 ng

Taq DNA polimeraz 0.25 µL 5 U/µL 1.25 U

Tablo 2.8: Clusterin rs3087554 A/G SNP bölgesini çoğaltmak için kullanılan PCR programı. İlk denatürasyon 94°C 3 dk. Denatürasyon 95°C 30 sn. Primer bağlanması 59°C 20 sn. Sentez 72°C 50 sn. Son uzama 72°C 10 dk

Clusterin rs3087554 A/G SNP için PCR ürünlerinin restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesilmesi

Clusterin rs3087554 A/G genotipleri, AciI restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilip, kesim ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonucunda gözlenen bantlarının büyüklüğüne göre belirlenmiştir. AciI enziminin tanıma bölgesi aşağıdaki gibidir (URL-17):

Clusterin rs3087554 A/G genetik polimorfizmininin genotiplerinin belirlenmesi şematik olarak Şekil 2.7’de açıklanmıştır. Clusterin rs3087554 A/G genetik

polimorfizmini belirlemek için üretilen PCR ürününde AciI enziminin tanıma bölgesi varsa, PCR ürünü AciI ile bekletildiğinde 335 bç’lik PCR ürününün 254 bç ve 81 bç’lik iki parçaya ayrılması beklenir. Agaroz jel elektroforezinde yürütülmüş olan restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilmiş PCR ürünü, 254 bç ve 81 bç boyutlarında iki ayrı bant şeklinde görünmektedir. Bu durumda bu PCR ürününün elde edildiği DNA örneğinin alındığı bireyin clusterin rs3087554 A/G genotipinin GG (polimorfik homozigot genotip) olduğuna karar verilir. PCR ürününde AciI enziminin tanıdığı nükleotit dizisi bulunmadığı takdirde, 335 bç’lik PCR ürünü kesilmeyip, agaroz jel elektroforezinde, kontrol amacıyla jele yüklenmiş (AciI restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilmemiş) 335 bç boyutundaki PCR örneğiyle aynı büyüklükte bir bant olarak görünmektedir. Bu durumda bu bireyin genotipinin AA (yabanıl homozigot genotip) olduğuna karar verilir. Heterozigot (AG) olan bireylerden elde edilmiş olan PCR örneklerinden bazılarında AciI enziminin kesim bölgesi varken, bazılarında ise bu kesim bölgesi bulunmamaktadır. Bu yüzden AciI enzimiyle muamele edilmiş PCR ürünü jele yüklendiğinde 335 bç, 254 bç ve 81 bç boyutlarında üç bant elde edilir.

Şekil 2.7: Clusterin rs3087554 A/G tek nükleotit polimorfizmine ait genotiplerin belirlenmesi ve şematik agaroz jel elektroforez görüntüsü.

Yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda clusterin rs3087554 A/G bölgesinin AciI restriksiyon endonükleaz enzimiyle kesilmesinde iyi bant veren PCR ürünlerinin 10 µL PCR ürününün 10 U AciI enzimiyle (Tablo 2.9), hafif silik bant veren PCR

ürünlerinin ise 20 µL PCR ürününün 20 U AciI enzimiyle (Tablo 2.10), 1 saat boyunca 37°C’de inkübe edilmesiyle elde edildiği belirlenmiştir.

Bu yöntemde öncelikle iyi bant veren PCR ürünlerinde clusterin rs3087554 A/G SNP için elde edilen 335 bç uzunluğundaki PCR ürünlerinin 10 µL’si 10 U AciI enzimiyle, silik bant veren PCR ürünlerinde 335 bç uzunluğundaki PCR ürünlerinin 20 µL’si 20 U AciI enzimi ile 37°C’de 1 saat inkübe edilir (Tablo 2.9 ve 2.10) ve inkübasyondan sonra kesim ürünleri %2.5’lik agaroz jelde analiz edilir. 335 bç’lik PCR ürünü GG polimorfik homozigot genotipi için 254 ve 81 bç’lik iki bant verirken, AA yabanıl homozigot genotipi kesilmemiş 335 bç’lik tek bant verir (Şekil 2.7).

Tablo 2.9: Clusterin rs3087554 A/G SNP bölgesi için restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesim karışım içeriği (iyi bant veren PCR ürünleri için).

İçerik 1 tüp için eklenen hacim Stok konsantrasyonu 30 µL reaksiyon karışımındaki son konsantrasyon Steril apirojen H2O 16 µL --- --- CutSmart Buffer 3 µL 10 X 1 X AciI 1 µL 10000 U/mL 10 U PCR ürünü 10 µL --- ---

Tablo 2.10: Clusterin rs3087554 A/G SNP bölgesi için restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesim karışım içeriği (silik bant veren PCR ürünleri için).

İçerik 1 tüp için eklenen hacim Stok konsantrasyonu 30 µL reaksiyon karışımındaki son konsantrasyon Steril apirojen H2O 5 µL --- --- CutSmart Buffer 3 µL 10 X 1 X AciI 2 µL 10000 U/mL 20 U PCR ürünü 20 µL --- ---

Bu polimorfizm için RFLP yönteminin genotipleri doğru belirleyip belirlemediğini test etmek amacıyla, genotipi PCR-RFLP ve agaroz jel elektroforezi yöntemi ile belirlenmiş olan, homozigot yabanıl tip (AA) ve homozigot polimorfik genotipe (GG) sahip iki bireyin PCR ürünü seçilerek sekanslamaya yollanmıştır. Sekanslama işlemi ABI 310 DNA dizi analizi cihazında Ref-Gen firmasından hizmet alımı ile gerçekleştirilmiştir. Şekil 2.8’de sunulan sekansa göre RFLP ile homozigot yabanıl tip (AA) genotipe sahip olduğuna karar verilen bireyin DNA’sından elde edilen PCR

ürününde beklenildiği gibi AciI için kesim bölgesi olarak tanınmayan GCAG dizisi görülmüştür. Şekil 2.9’da sunulan sekansa göre ise RFLP ile homozigot polimorfik genotipe (GG) sahip olduğuna karar verilen bireyin DNA’sından elde edilen PCR ürününde beklenildiği gibi AciI için kesim bölgesi olarak tanınan GCGG dizisi görülmüştür. Bu sonuçlara göre PCR-RFLP yöntemi ile karar verilen genotiplerin doğruluğu teyit edilmiştir.

2.2.3 Clusterin rs1532278 C/T ve rs2279590 C/T tek nükleotit polimorfizmlerinin