Son yıllarda kullanılan moleküler tekniklerde meydana gelen hızlı ilerlemeler sayesinde mikroorganizmaların DNA analizlerinin yapılabilmesi, klinik mikrobiyoloji çalışmalarında geleneksel kültür yöntemlerine karşı alternatif olarak bazı moleküler tekniklerin kullanımını gündeme getirmiştir. P. aeruginosa ve S. aureus kompleks DNA analiz çalışmalarında son dönemlerde yaygın olarak kullanılan ve çok hassas moleküler bir yöntem olduğu belirlenen PCR kullanılmaktadır. Bu tür moleküler tekniklerinin avantajlarının başında PCR’ın bir kez çalışmasında birden çok örneğin bir arada test edilmesi ile araştırmaya kazandırdığı hız ve testlerin istenildiği anda tekrarlanabilir olması çalışmaya güvenirlilik kazandırmaktadır (Van Pelt ve ark., 1999; Vandamme ve ark., 1994).
PCR tekniğinde kullanılan genetik materyal çok az miktarda bile olsa çoğaltılabilir ve kolaylıkla tanımlanabilir. PCR tekniği ile laboratuar tanısına büyük bir hız ve kesinlik kazandırılmıştır. Bu teknik, mikrobiyolojik çalışmaların vazgeçilmezi olmuştur (Mahenthiralingam ve ark., 1996).
Tanı amaçlı gerçekleştireceğimiz PCR’larda, herhangi bir biyolojik sıvıyı DNA izolasyonu yapmaksızın doğrudan kullanabilmemize imkan veren enhancer kombinasyonları oluşturmamızı sağlamıştır. Çalışmamızda PCR reaksiyon karışımına doğrudan pipet ucuyla S. aureus ve P. aeruginosa bakterileri koloniden alınarak katıldığından reaksiyonların gerçekleştirildiği her bir PCR tüpündeki kalıp miktarı birbirinden farklı olabilir. Farklı enhancer kombinasyonlarının kullanıldığı bu PCR ürünleri, verim açısından birbirleriyle karşılaştırılarak doğru sonuçlara ulaşılmayabilir. Burada önemli olan hangi kombinasyonun PCR verimini ne ölçüde artırdığı değil, mikrobiyolojik tanı amaçlı olup olmadığıdır. PCR’ın verimini ve spesifitesini artırmaya yönelik yeni kimyasalların ilavesi, daha önceki çalışmalarımızda E. coli mikroorganizması üzerinde denenmişti. Bu enhancer karışım eldesi bu çalışma için bize ön hazırlık oluşturmuştur.
Yapılan literatür çalışmalarında Sülfolane’nin ve 2 Pyrolidon’un sırasıyla literatürde en iyi performans gösteren düşük moleküler ağırlıklı sülfon ve düşük moleküler ağırlıklı amit olarak baz eşleşmesini destabilize ettiği ve böylece GC’ce zengin kalıpların amplifikasyonunu kolaylaştırdığı tespit edildiğinden enhancer kombinasyonlarında kullanılmasına karar verilmiştir.
Betaine ve trehalose compatible soluteler sınıfına ait iki bileşik olup sıcaklık ve tekrarlanan ısıtma/soğutma döngüleri gibi stresörlere karşı proteinleri koruma yeteneklerine sahiptirler ve dolayısıyla PCR’ın denatürasyon aşamaları süresince polimerazı stabilize ederler (Schnoor ve ark., 2004). Ayrıca Betaine DNA üzerinde izostabilize edici etkiye sahiptir yani DNA çift zincirinin stabilitesine GC- ve AT-baz eşleşmesinin katkısını eşitler (Frackman ve ark., 1998), GC’ce zengin bölgelerin neden olduğu sekonder yapının oluşumunu azaltarak bu genlerin amplifikasyonunu kolaylaştırır. Trehalose da Taq polimerazı stabilize edici etkisinin yanı sıra DNA melting sıcaklığını düşürerek GC’ce zengin kalıpların PCR’ını büyük ölçüde kolaylaştırır (Spiess ve ark., 2004). Betaine ve trehalose bu sözü edilen özelliklerinden dolayı enhancer kombinasyonlarında kullanılmak üzere seçilmiştir.
DMSO’nun, GC’ce zengin bölgelerin neden olduğu sekonder yapının oluşumunu azaltarak ve baz eşleşmesini destabilize ederek bu genlerin amplifikasyonunu iyileştirdiği (Chakrabarti ve Schutt, 2002) ayrıca mikroorganizmaların membran yapısına zarar vererek PCR’da kalıp olarak DNA izolasyonu yapmaksızın doğrudan mikroorganizmaların kullanılmasına imkan vereceği düşünüldüğünden enhancer kombinasyonunda kullanılmasına karar verilmiştir.
Yapılan literatür çalışmalarında iyonik olmayan deterjanlardan Tween 20 ve Triton X 100’ün Taq DNA polimerazı stabilize ettiği ve sekonder yapı oluşumunu durdurabildiği (Gelfand, 1988) yönünde bilgilere ulaşıldığı ve PCR’da kalıp olarak DNA izolasyonu yapmaksızın doğrudan mikroorganizmaların kullanılabilmesine imkan verebileceği düşünüldüğü için enhancer kombinasyonlarında kullanılmasına karar verilmiştir.
Kendi başına enzimatik reaksiyon üzerinde doğrudan etkiye sahip olmayan BSA, enzimleri stabilize edebildiği ve DNA kalıp preparatında ya da reaksiyon tamponlarında mevcut olabilen inhibe edici kontaminantları nötralize edebildiği için enhancer kombinasyonlarına ilave edilmiştir (Buckingham ve Flaws, 2007).
Polimeraz zincir reaksiyonları, belirlenen annealing sıcaklıklarında ve belirlenen protokoller doğrultusunda aynı anda herhangi bir enhancer ilavesi yapılmaksızın ve Tablo 3.3’de verilen enhancer kombinasyonları kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Şekil 4.1., ‘‘Thermal Cycler’ın Program Ayarı’’ 3.2.3.1. bölümde tanımlanan bir Touch Down PCR prosedürü takip edilerek gerçekleştirilen PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsüdür. Bu PCR’da genomik DNA saflaştırılmaksızın P. aeruginosa reaksiyon karışımına doğrudan katılmıştır. Aşağıda, jele ait bu fotoğraf incelenerek PCR’da kullanılan enhancer kombinasyonlarının amplifikasyon üzerine etkileri değerlendirilmiştir.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Şekil 4.1. P.aeruginosa Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV Transilüminatörden elde edilen görüntüsü.
1., 2., 3. kuyucuk sırasıyla Tablo 3.3’de verilen 1, 2, 3 kodlu enhancer ; 4. kuyucuk (PA-SS-F, PA-SS-R) kontrol (enhancersiz); 5.kuyucuk DNA ladder ; 6. kuyucuk (ECF1, ECF2) kontrol (enhancersiz); 7., 8., 9., 10. kuyucuk sırasıyla Tablo 3.3’de verilen 1, 2, 3, 4 kodlu enhancer.
1000 750 500 250
1., 2., 3., 7., 8., 9., 10. kuyucukta Tablo 3.3’de verilen enhancer kombinasyonlarına ait karışım, koloniden direkt pipet ucuyla alınarak PCR karışımına katılan P. aeruginosa bakterisi üzerinde kabul edilebilir düzeyde bir bant göstermiştir. Burada önemli olan verim değildir, mikroorganizmanın mikrobiyolojik tanı amaçlı kullanılabileceğidir. 4. ve 6. kuyucukta herhangi bir enhancer karışımı kullanılmamıştır ve görüldüğü üzere bir bant da elde edilememiştir. Bu da enhancer karışımları kullanıldığında, PCR üzerinde yarattığı verimi ve spesifiteyi göstermektedir.
Çalışmada Touch Down PCR sonucunda yapılan agaroz jel elektroforezinde Pseudomonas aeruginosa için 1., 2., 3. kuyucukta 956bp ve 7., 8., 9., 10. kuyucukta 528bp büyüklüğünde bantların oluşumu saptandı. Belirlenen örnekler P. aeruginosa olarak kabul edilmiştir.
Şekil 4.2., ‘‘Thermal Cycler’ın Program Ayarı’’ 3.2.3.1. bölümde tanımlanan bir Multiplex PCR prosedürü takip edilerek gerçekleştirilen PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsüdür. Bu PCR’da birden fazla hedef dizi birlikte çoğaltılmış ve genomik DNA saflaştırılmaksızın P. aeruginosa reaksiyon karışımına doğrudan katılmıştır. Aşağıda, jele ait bu fotoğraf incelenerek PCR’da kullanılan enhancer kombinasyonlarının amplifikasyon üzerine etkileri değerlendirilmiştir.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Şekil.4.2. P.aeruginosa Multiplex PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV Transilüminatörden elde edilen görüntüsü.
1. kuyucuk DNA ladder; 2. ve 3. kuyucuk sırasıyla Tablo 3.3’de verilen 2, 3 kodlu enhancer; 4. kuyucuk (PASS-F, PASS-R) kontrol (enhancersiz); 5. ve 6. kuyucuk sırasıyla Tablo 3. 3’ de verilen 2, 3 kodlu enhancer; 7. kuyucuk (ECF1, ECF2) kontrol ( enhancersiz); 8. kuyucuk multiplex (enhancersiz); 9. ve 10. kuyucuk sırasıyla Tablo 3. 3’ de verilen 2, 3 kodlu enhancer.
1000 750 500 250
Tablo 3.3’deki enhancer karışımı PCR’ ın spesifitesini artırmıştır ve 2., 3. kuyucukta 956 bp büyüklüğünde bantlar elde edilmiştir. 4. kuyucukta enhancer karışımı olmadığından herhangi bir bant görüntüsü bulunmamaktadır. 5. ve 6. kuyucukta Tablo 3.3’deki enhancer karışımları kullanılarak 528 bp büyüklüğünde bantlar elde edilmiştir. 7. ve 8. kuyucukta enhancer karışımı kullanılmadığından herhangi bir bant gözlemlenememiştir. 9. ve 10. kuyucukta ise Multiplex PCR’ a ait Tablo 3.3’de verilen karışımlar kullanılarak, aynı anda 528 bp ve 956 bp’daki bant görüntüleri gözlemlenmiştir. Bu da kullanılan enhancer karışımlarının PCR’ da mikrobiyolojik tanı amaçlı kullanılabileceğini göstermektedir.
Çalışmada Multiplex PCR sonucunda yapılan agaroz jel elektroforezinde Pseudomonas aeruginosa için 956 bp ve 528 bp büyüklüğünde bantların oluşumu beklenmiştir. Saptanan örnekler P. aeruginosa olarak kabul edilmiştir.
Şekil 4.3., ‘‘Thermal Cycler’ın Program Ayarı’’ 3.2.3.1. bölümde tanımlanan bir Touch Down PCR prosedürü takip edilerek gerçekleştirilen PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsüdür. Bu PCR’da S. aureus’a ait genomik DNA saflaştırma işlemine gidilmiştir. Aşağıda, jele ait bu fotoğraf incelenerek PCR’da kullanılan enhancer kombinasyonlarının amplifikasyon üzerine etkileri değerlendirilmiştir.
Ardından Touch Down PCR prosedürü takip edilerek gerçekleştirilen PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden görüntüsü elde edildi. Bu PCR’ da diğerlerinden farklı olarak genomik DNA saflaştırması yapılmıştır.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Şekil 4.3. S. aureus Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV Transilüminatörden elde edilen görüntüsü.
831
564
1. kuyucuk saflaştırılmış genomik DNA (CoA); 2. kuyucuk saflaştırılmış genomik DNA (EntA); 3. kuyucuk saflaştırılmış genomik DNA (NUC); 4. kuyucuk saflaştırılmış genomik DNA (Seg); 5. kuyucuk λ/Ecor I Hind III markör; 6. kuyucuk sıvı S. aureus kültürü (CoA); 7. kuyucuk sıvı S. aureus kültürü (EntA); 8. kuyucuk lizostafin ilaveli sıvı S. aureus kültürü (NUC); 9. kuyucuk lizostafin ilaveli sıvı S. aureus kültürü (Seg). 3. ve 4. kuyucukta saflaştırılmış genomik DNA için NUC ve Seg primerlerine ait bantlar gözlemlenmiştir. 8. ve 9. kuyucuk’ta lizostafin ilaveli sıvı S. aureus kültürü için NUC ve Seg primerlerine ait bantlar gözlemlenmiştir.
Şekil 4.4., ‘‘Thermal Cycler’ ın Program Ayarı’’ 3.2.3.1. bölümde tanımlanan bir Touch Down PCR prosedürü takip edilerek gerçekleştirilen PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsüdür. Bu PCR’da S. aureus’a ait genomik DNA saflaştırma işlemine gidilmiştir. Aşağıda, jele ait bu fotoğraf incelenerek PCR’da kullanılan enhancer kombinasyonlarının amplifikasyon üzerine etkileri değerlendirilmiştir.
1 2 3 4 5 6 7
Şekil 4.4. S. aureus Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV Transilüminatörden elde edilen görüntüsü.
1. kuyucuk saflaştırılmış genomik DNA (NUC); 2. kuyucuk saflaştırılmış genomik DNA (Seg); 3. kuyucuk sıvı S. aureus kültürü (NUC); 4.kuyucuk sıvı S. aureus kültürü (Seg); 5. kuyucuk λ/Ecor I Hind III markör; 6. kuyucuk koloni S. aureus (NUC); 7. kuyucuk koloni S. aureus (Seg). 1. ve 2. kuyucukta saflaştırılmış genomik DNA’ya ait bantlar belirgin bir şekilde gözlemlenmiştir. Bu da mikroorganizmaların belirlenmesinde PCR’ın mikrobiyolojik tanı amaçlı kullanımının önemini vurgulamaktadır. 1904 1584 1375 947 831 564
5. SONUÇ
Enfeksiyon hastalıklarının tanısının konulması, tedaviye hangi ilaç ile başlanacağının belirlenmesi açısından çok önemlidir. Hastanın tedavisine ne kadar çabuk başlanırsa o kadar hızlı sonuç alınır. Araştırıcılar moleküler düzeylerde yapılan analizlerin bakterilerin belirlenmesi için daha güvenilir sonuçlar vereceğini belirtmişlerdir (Laguerre ve ark., 1994).
PCR yöntemiyle hastalığı yapan mikroorganizmanın hızlı ve kesin tanısı konulabilmektedir. Bu da PCR yönteminin yaygın olarak kullanımını sağlamıştır. PCR yöntemi etkenin bulunmasında diğer yöntemlere göre daha pahalı bir yöntemdir. Ancak yaşamsal önemi olan vakalarda etkenin gösterilmesi daha çabuk, daha hassas ve daha özgün olduğu için klasik bakteriyolojik yöntemler yerine tercih edilmektedir (Güran ve ark., 1996). PCR reaksiyonunda kullanılan primerler P. aeruginosa ve S. aureus genine özgün olduğu için PCR tekniği ile mikroorganizmanın P. aeruginosa ve S. aureus olup olmadığı da kesin olarak ayrılabilmektedir.
Lavenir ve arkadaşlarının 2007 yılında yaptığı gibi literatürde bulunan diğer çalışmalarda, gram negatif bir mikroorganizma olan P. aeruginosa’nın tanısında DNA saflaştırma işlemine gidilmiştir. Bizim çalışmamız bu mikroorganizma için DNA saflaştırma işlemine gidilmeksizin doğrudan koloni PCR ile veya sıvıdan santrifüjle alınan mikroorganizmanın kesin tanısının konulması olmuştur. S. aureus için genomik DNA izolasyonu, koloni, lizostafin ilaveli sıvı kültür, sadece sıvı kültür üzerinde yaptığımız PCR ile elde ettiğimiz bantlar karşılaştırılmıştır. Direkt koloniden bant elde edilememiş ancak genomik DNA saflaştırılması işlemiyle bant gözlemlenebilmiştir. Bunun yanı sıra sıvı kültür ilavesiyle bant gözlemlenemezken, lizostafin eklenmiş sıvı kültür ilavesinde bant gözlemlenmiştir. Amacımız burada yaptığımız işelemlerle PCR’ın verimliliğini karşılaştırmak olmayıp, sadece mikroorganizmanın saptanmasını etkili bir şekilde sağlamak ve klinik tanıda süreyi kısaltarak daha hızlı bir sonuç elde etmektir. Çünkü erken tanı tedaviye çabuk başlamada önemlidir. Çalışmamızda P. aeruginosa mikroorganizması DNA izolasyonu yapmadan kısa sürede saptanmıştır.
Ayrıca S. aureus mikrorganizması için ise direk PCR işleminden önce lizostafinle 30 dakikalık bir ön inkübasyon yapılarak PCR ile tanısı yapılabilmektedir.
Tanı amaçlı gerçekleştirilecek PCR’larda kalıp olarak DNA izolasyonu yapılmaksızın doğrudan mikroorganizmalar kullanıldığında;
• 1 M Betaine+ 5% (v/v) DMSO,
• 0,2 M Trehalose+0,011 mg/ml BSA+5% (v/v) DMSO+0,1 M 2-Pyrolidon+1% (v/v) Tween 20,
• 1 M Betaine+0,011 mg/ml BSA+5% (v/v) DMSO+0,1 M 2-Pyrolidon+1% (v/v) Tween 20,
• 0,2 M Trehalose+5% (v/v) DMSO+0,011 mg/ml BSA+0,1 M Sülfolane+1% (v/v) Triton X–100.
bileşimlerinden oluşan enhancer kombinasyonlarının kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
KAYNAKLAR
Akar, N., 1999. Klinik Moleküler Patolojiye Giriş. Ankara Antıp A.Ş. 381.
Ang, O., 2006. Mikrobiyoloji. Lippincott's Illustrated Reviews, Nobel Tıp Kitabevleri. Anonim, 2006. Orlab On-line Mikrobiyoloji Dergisi. www.microbiology.org/pdf. (07.08.08). Anonim, http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000097 (10.10.09). Anonim, http://www.newgenn.com/microbes/bacteria/pseudomonas-aeruginosa.html. (10.10.09). Anonim, http://www.biology4kids.com/extras/dtop_micro/7821.html. (15. 08.09). Anonim, http://www.microbelibrary.org/asmonly/details.asp?id=2296.
American Society for Microbiology, Washington DC. (15.08.09).
Anonim, http://randstarteam.blogspot.com/2007/12/medical-microbiology-case-1-blog- 2. html. (15.09.09).
Brakstad, O. G., Aaasbak, K. T., Maeland, J. A., 1992. Detection of Staphylococus aureus by Polymerase Chain Reaction Amplification of the nuc gene. Journal of Clinical Microbiology, 1654-1660.
Buckingham, L and Flaws M.L., 2007. Molecular Diagnostics, F. A. Dawis Company, 264-289.
Burtis, C. A., Aswood, E. R., 2005. Klinik Kimyada Temel İlkeler (Tietz), Palme Yayınları.
Chakrabartı, R., Schutt, C. E., 2002. Novel Sulfoxides Facilitate GC-Rich Template Amplification, BioTechniques, 32, 866-874.
Cremonesi, P., Luzzana, M., Brasca, M., Morandi, S., Lodi, R., Vimercati, C., Agnellini, D., Caramenti, G., Moroni, P., Castiglioni, B., 2005. Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products. Molecular and Cellular Probes, 19, 299-305.
De La Puente-Redondo, V.A., Del Blanco N. G., Gutierrez-Martin C. B., Garcia-Pera F. J., Ferri, E. F. R., 2000. Comparision of different PCR approaches for typing of Francisella tularensis strains. J Clin Microbiol, 38, 22-1016.
Dutton, G., 1998. Advances in Polymerase Chain Reaction. Genetic Engineering News, 16-18.
Gelfand, D.H., 1988. In Erlich, H.A. (ed) PCR Technology, Stocton Press NY, 17. Grunewald, H., 2003. Optimization of Polymerase Chain Reactions. Methods in
Molecular Biology, Bartlett, J., Stirling, D., 89-99, Humana Pres, Totowa NJ. Güran, Ş., Yılmaz, E., Bal, Ş., 1996. Tüberküloz peritonit vakasının polimeraz zincir
reaksiyonu ile tanısı, Yeni Tıp Dergisi, 13(1), 8-9.
Frackman, S., Kobs, G., Simpson, D., Storts, D., 1998. Betaine and DMSO: Enhancing Agents for PCR. Promega Notes, 65, 27-30.
Hrynkiewicz, K., Klodzinska, E., Dahm, H., Szeliga, J., Jackowski, M., Buszewski, B., 2008. Combination of capillary electrophoresis: PCR and physiological assays in differentiation of clinical strains of Staphylococcus aureus. Research letter. FEMS microbiol Lett, 286, 1-8.
Ignatov, K. B., Miroshnikov, A.I., Kramarov, V. M., 2003. A New Approach to Enhanced PCR Specifitcity. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 29, 368- 371.
Iscan, M., 2003. Moleküler Genetikte Modern Teknikler. Biyoinfarmatik-1, Telefoncu, A., Kufrevioglu, O., Pazarlıoglu, N., Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir, 71-77. Kocazeybek, B.Z., 2007. Olgu Dosyaları: Mikrobiyoloji, Nobel Tıp Kitabevleri.
Köksal, F., 1999. Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin Hastane İnfeksiyonlarında Kullanımı. Hastane İnfeksiyonları Dergisi, 3, 95-189.
Kurupatia, P., Kumarasinghec, G., Laa Poa C., 2005. Direct İdentification of Pseudomonas aeruginosa from blood culture bottles by PCR- enzyme linked immunosorbent assay using oprI gene spesific primers. Molecular and cellular Probes, 19, 417-421.
Laguerre, G., Rigotter-Gois, L., and Lemanceau, P., 1994. Fluorecent Pseudomonas species categorized by using PCR/restriction fragment analysis of 16s rDNA. Mol. Ecol., 3, 479-487.
Lavenir, R., Jacktane, D., Laurent, F., Nazaret, S., Cournayer, B., 2007. Improved reliability of Pseudomonas aeruginosa PCR detection by the use of the species- spesific ecfX gene target. Journal of Microbiological Methods, 70, 20-29.
Lyncnh, J., Brown, J., 1990. The Polymerase chain reaction. Current and Future clinical applications, 27, 2-9.
Mahenthiralingam, E., Campbell, M. E., Faster, J., Lam, J. S., Speert, D. P., 1996. Random amplified polymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol, 34, 1129-1135.
Mc Kane, L., Kandel, Y., 1996. Microbiology Essentials and Applications. Boston, 33-45.
McPherson, M., Moller, S., 2007. PCR, 288, Taylor & Francis.
Morshed, M.G., Lee, M., Jorgensen, D., Isacc-Renton J.L., 2007. Molecular methods used in clinical laboratory: prospects and pitfalls, 49, 184-191.
Palomares, C., Torres, M.J., Torres A., Aznar J., Palomares, J.C., 2003. Rapid detection and identification of Staphylococcus aureus from blood culture specimens using real-time fluorescence PCR. Diagnostic Microbiology and İnfectious Disease, 45, 183-189.
Pitt, T. L., Govan, J. R. W., 1993. Pseudomonas cepacia and cyctic fibrosis PHLS. Microbiol. Dig., 10, 69-72.
Prescott, M. L., Harley, J., Klein, D., 1999. Microbiology. Boston, 78-99.
Relman, D. A., Persing, D. H., 1996. Genotypic methods for microbial identification. PCR Protocols for Emercing Infectious Disease, 3-31.
Schnoor, M., Voß, P., Cullen, P., Böking, T., Galla, H.-J., Galinski, E. A., Lorkowski, S., 2004. Characterization of the synthetic compatible solute homoectoine as a potent PCR enhancer. Biochemical and Biophysical Research Communications, 322, 867-872.
Song, K. P., Chan, T.K., Ji, Z.L., Wong, S.W., 2000. Rapid identification of Pseudomonas aeruginosa from ocular isolates by PCR using exotoxin A-spesific primers. Molecular and Cellular Probes, 14, 199-204.
Spiess, A-N., Mueller, N., Ivell, R., 2004. Trehalose Is a Potent PCR Enhancer: Lowering of DNA Melting Temperature and Thermal Stabilization of Taq Polymerase by the Disaccharide Trehalose. Clinical Chemistry, 50(7), 1256- 1259.
Taylor, G., 1993. Polymerase chain reaction , basic principles automation, Oxford University pres, Oxford, 1-15.
Temizkan, G., Arda, N., 2004. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler, Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul, 101-119.
Topçu, A.W., Soyletir, G., Doganay, M., 2002. İnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi. Nobel Tıp Kitabevleri, 1608- 1616.
Topçu, Z., 2007. Moleküler Biyoloji, Biyoinformatik ve Temel Teknikler. Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Modern Teknikler, Telefoncu, A., Erbil, M.K., Zihnioğlu, F., Kılınç, F., 271-289, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir.
Ustaçelebi, Ş., Mutlu, G., Imir, T., 1999. Temel ve Klinik Mikrobiyoloji, 35, 557. Ustuner, D., 1996. Değişik klinik örneklerde tüberkülozun PCR ile kesin ve hızlı tanısı.
(Y. Lisans Tezi), Osmangazi Üniversitesi, Eskişehir.
Van Pelt, C., Verduin, C. M., Goessens, W. H. F., Vos, M. C., Tümler, B., Segand, C., Reubsaet, F., Verbrugh, H., and Van Belkum, A., 1999. Identification of Burk holderis spp. In the clinical microbiology: comprasion of conventional and mole cular methods. J. Clin. Microbiol, 2158-2164.
Vandamme, P., Pot, B., Gillis, M., De Vos, P., Kersters, K., and Swings, J., 1996. Polyhasic taxonomy, a consencus approach to a bacterial systmatics. Microbio Rev. 60, 407-438.
Wesam, A. H., 2009. Molecular Identification of antibiotics resistant Pseudomonas aeruginosa Wt. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3,
2144-2153.
ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler
Adı Soyadı : Ergül MUTLU ALTUNDAĞ
Doğum Tarihi ve Yer : 15.10.1981 Tosya Medeni Hali : Evli
Yabancı Dili : İngilizce
Telefon : 0542-401-61-34
e-mail : ergul_mutlu@hotmail.com.
Eğitim
Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi
Lisans Karadeniz Teknik
Üniversitesi / TRABZON
2003
Lise Amasya Yabancı Dil
Ağırlıklı Lisesi/AMASYA