Yapılan bu tez çalışmasında rastgele seçilen epididimis doku preparatlarından her iki fiksatife ait iki lam alınarak PAS boyama yapıldı.
PAS boyası yapılan epididimis doku preparatlarında her iki fiksatif için ayrı ayrı değerlendirildiğinde; epitetel hücrelerinin bazal membran yapılarının boyanma netliği incelenmiştir.
mDF’ye ait preparatlar incelendiğinde bazal membran yapısının BF’ye ait preparatlara oranla daha keskin hatlarda olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.13.- 4.16.).
46
Şekil 4.13. mDF’ye ait epididimis dokusunun PAS boyama görüntüsü x40
47
Şekil 4.15. mDF’ye ait epididimis dokusunun PAS boyama görüntüsü x10
48
Şekil 4.17. BF’ye ait epididimis dokusunun PAS boyama görüntüsü x20
49 4.4. Stereolojik Bulgular
BF’den elde edilen verilerde; Vönce ortalaması =0.580, Vsonra ortalaması =0.134, Çekme ortalaması =0.758 ve CE ortalaması =0.017 bulunmuştur (Tablo 4.1.).
Modifiye Davidson Fiksatifinden elde edilen verilerde; Vönce ortalaması =0.512, Vsonra ortalaması =0.142, Çekme ortalaması =0.714 ve CE ortalaması
=0.018 bulunmuştur (Tablo 4.1.).
Epididimis dokusunda ölçeğin genel analiz sonuçlarına göre; Vönce ortalamasının =0.546 olduğu, Vsonra ortalamasının =0.138 olduğu, Çekme ortalamasının =0.736 olduğu ve CE ortalamasının =0.0175 olduğu bulunmuştur (Tablo 4.1.). x x x x x x x x x x x x
50
Tablo 4.1. Bouin ve Modifiye Davidson Fiksatifi ile Tespit Edilen Epididimis Dokusunun Cavalieri Prensibi Kullanılarak Elde Edilen Hacim Analizi
Epididimis dokusu için kullanılan bouin ve modifiye davidson fiksatiflerinde stereolojik analizler için kullanılan cavalieri prensibi ile elde edilen hacimlerin Mann-Whitney U sonuçlarına göre; Vönce değişkeni (p=0.924), Vsonra değişkeni (p=0.449), Çekme değeri (p=0.225) ve CE değeri ise (p=0.615) bulunmuştur. Genel Fiksatif
n
SS
Median Min. Max.Vönce (cm³) BF 10 0.580 ±0.125 0.551 0.465 0.880 MDF 10 0.512 ±0.0834 0.498 0.389 0.646 Toplam 20 0.546 ±0.109 0.528 0.389 0.880 Vsonra (cm³) BF 10 0.134 ±0.0394 0.118 0.079 0.217 MDF 10 0.142 ±0.0262 0.144 0.100 0.180 Toplam 20 0.138 ±0.0328 0.139 0.079 0.217 Çekme (%) BF 10 0.758 ±0.0772 0.76 0.65 0.91 MDF 10 0.714 ±0.0729 0.71 0.59 0.83 Toplam 20 0.736 ±0.0765 0.73 0.59 0.91 CE (%) BF 10 0.017 ±0.0048 0.02 0.01 0.02 MDF 10 0.018 ±0.0042 0.02 0.01 0.02 Toplam 20 0.017 ±0.0044 0.02 0.01 0.02 sira
x
51
anlamda tüm değişkenler için bulunan değerler göz önünde alındığında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p˃0.005) (Tablo 4.2.).
Tablo 4.2. Bouin ve Modifiye Davidson Fiksatif ile Tespit Edilen Epididimis Dokusunun Cavalieri Prensibi Kullanılarak Ölçülen Hacimlerinin Mann- Whitney U Testi Analiz Sonuçları
Fiksatif
n
S.T. U ZP
V önce (cm³) BF 10 12.05 34.50 -1.17 0.241 MDF 10 8.95 Toplam 20 V sonra (cm³) BF 10 9.50 40.00 -0.76 0.449 MDF 10 11.50 Toplam 20 Çekme (%) BF 10 12.10 34.00 -1.21 0.225 MDF 10 8.90 Toplam 20 CE (%) BF 10 10.00 45.00 -0.50 0.615 MDF 10 11.00 Toplam 2052
5. TARTIŞMA
Bu çalışmadaki amaç, bir dokunun morfolojik olarak incelenme aşamasında en önemli etmenlerden biri olan tespit sürecinde epididimis dokusunun hücresel bütünlüğünü koruyan, dokuların boyanma kalitesini artıran ve stereolojik olarak incelenmesini kolaylaştıran fiksatifleri ortaya çıkarmaktır.
Günümüzde yaşadığımız çevreyi kirleten pek çok fiziksel ve kimyasal etkenin erkek üreme sistemi üzerinde toksik etkiler oluşturduğu bilinmektedir (Mills ve ark., 1977). Özellikle ağır metaller ve endokrin sisteme zarar verici kimyasallar erkek üreme sistemini olumsuz etkileme potansiyeline sahiptir (Diamanti-Kandarakis ve ark., 2009).
Bu sebeple üreme sisteminde meydana gelebilecek her türlü hastalığın erken teşhis edilebilmesi ve tanı koyulabilmesi için doku histolojisi hakkında geniş ve kapsamlı bilgi sahibi olmak gerekir. Aynı zamanda epididimis dokusunun incelenmesi hem klinik çalışmalarda hemde laboratuvar deneylerinde sperm oluşumu ve epididimis fonksiyonunun değerlendirilmesi açısından önem arz etmektedir (Mills ve ark., 1977).
Epididimis dokusu hakkında histopatolojik olarak araştırma yapmadan önceki ve en önemli aşama dokuların yapısını koruyan solüsyonlarda tespit edilmesidir. Birçok organla karşılaştırıldığında epididimis dokusunun tespit edilmesi histolojik ve immünohistokimyasal olarak analiz edilmesi sahip olduğu minimal düzeydeki bağ dokusu nedeniyle zordur (Doran, 2005; Howran ve ark., 2005).
Fiksasyon süreci histololojik ve morfolojik çalışmaların önemli bir parçasını oluşturmaktadır. Fiksatifler dokuların morfolojisini, protein yapısını ve histokimyasal boyanmasını olumsuz etkileyebilir. Bu nedenle, yapılacak çalışmaya ve dokuya uygun fiksatif seçimi dikkatlice yapılmalıdır (Doran, 2005; Howran ve ark., 2005). Bu yüzden uygulanacak olan fiksatif solüsyonu; dokunun büzüşmesine neden olmamalı, kesit alınırken kolaylık sağlamalı, dokunun morfolojik özelliklerini değiştirmeden korumalı, dokunun boyanmasını kolaylaştırmalı ve sonrasında
53
yapılacak olan stereolojik çalışmalar için elverişli hale getirmelidir (Lihui ve ark., 2011).
Çalışmamızda 10 adet Sprague Dawley cinsi sıçan kullanıldı. Bu hayvanlardan alınan epididimis dokuları bouin ve modifiye davidson fiksatifleri içerisinde tespit edildi. Toplamda tespit edilen 20 adet epididimis dokusu doku takip aşamalarından geçirilip, sonrasında parafine gömme işlemi yapıldı. Elde edilen doku bloklarından seri kesitler alındı. Bu kesitlere H&E, MTC ve PAS boyaması yapıldı. MTC ve PAS boyamalarında dokunun epitel hücrelerinin bazal membran yapıları, bağ dokusu ve tübülleri etrafını saran düz kas tabakası değerlendirildi. H&E ile boyanan kesitler üzerinden stereolojik analizler yapabilmek için cavalieri prensibi ile hacim ölçümü gerçekleştirildi.
Çalışmamızda epididimis dokusu üzerinde yapılan deneysel süreçler ve değerlendirmeler sonucunda kullanılan fiksatifler karşılaştırıldığında mDF fiksatifi ile tespit edilen doku örneklerinde nükleer ve tübüler çözünürlük daha net bir şekilde gözlenmiştir. Ayrıca morfolojik olarak dokularda herhangi bir şekilde büzüşme gözlenmemiştir. Bouin fiksatifi mDF fiksatifine alternatif olarak kullanılabilir. Yapılan bazı çalışmalarda, mDF içerisinde BF’nin de olduğu birçok fiksatifle karşılaştırıldığında hayvan testis ve epididimis gibi organlar için en uygun fiksatif olduğu kabul edilmiştir. Bunun nedeni ise; dokunun histolojik yapısını mükemmel seviyede koruması, bouin fiksatifine göre daha güvenilir ve kullanımının kolay olması gösterilmiştir (OECD, 2001).
Bouin fiksatifi içerdiği pikrik asit nedeniyle, birçok dezavantaja sahiptir. Patlayıcı, mutajenik, kanserojen, tahriş edici ve alerjendir. Yapısındaki pikrik asit tespit solüsyonunun dokulara yavaş nüfuz etmesine neden olur. Dokunun sahip olduğu glikojenin korunması için olumlu bir etki sağlarken, dokunun büzüşmesine neden olarak olumsuz bir durum oluşturur (Tu ve ark., 2011). Buna ek olarak dokunun içerisinden pikrik asit yapısını çıkarabilmek için çok fazla sayıda alkol serilerinden geçirilmesi gerekmektedir. Bu durum daha sonra dokuların boyanma kalitesine olumsuz yönde etkide bulunacaktır (Lanning ve ark., 2002).
54
Birçok araştırmacı tıbbi ürünlerin ve kimyasalların üreme üzerindeki etkisini tespit etmek amacıyla Bouin solüsyonunu testis dokusu için tavsiye etmesine rağmen, daha iyi bir fiksatif olabileceğini düşünmüşlerdir.
Dikkat edilecek diğer bir husus dokuların Bouin ve Modifiye Davidson fiksatiflerinde 48 saatten daha uzun bir süre bırakılmamasıdır. Bu durum dokunun sertleşmesine neden olur ve ayrıca dokunun kesilmesini zorlaştırır (Tu ve ark., 2011). Latendresse ve ark. (2002), mDF ile tespit edilmiş testis doku örneklerinin Bouin fiksatifine oranla daha az büzülmeye ve daha iyi morfolojiye sahip olduğunu bulmuşlardır. H&E ile boyanmış doku kesitleri incelendiğinde de nükleer detayın mDF fiksatifinin daha iyi koruduğu gözlenmiştir. Sitoplazmanın hücresel korunumu mDF fiksatifi kullanılarak gerçekleşmiştir. Aynı zamanda stereolojik çalışmalarda hücresel sayımların yapılabilmesine olanak tanıyan çekirdeklerin daha iyi ayırt edildiği bilgisine ulaşmışlardır.
Bu tez çalışmasının deneysel süreçlerinin sonunda elde ettiğimiz verilerle literatür taramasında elde ettiğimiz bilgi ve sonuçların aynı doğrultuda olduğunu saptadık. Bu durum yaptığımız çalışmanın güvenilirliğini ortaya koymuştur.
Testis ve göz dokusu ile ilgili çalışmalarda mDF fiksatifinin bouin fiksatifinin yerine kullanılabileceği vurgulanmıştır. Bu iki fiksatifin yetişkin hayvan testis morfolojisini en iyi şekilde koruduğu da belirtilmiştir. Aynı zamanda dokular boyanma kalitesi bakımından değerlendirildiğinde mDF ile fikse edilmiş doku örneklerinde görüntünün daha belirgin ve net olduğu savunulmuştur (Lanning ve ark., 2002).
Chapin (1984), mDF ile tespit edilmiş testis doku örneklerindeki nükleer detay BF ile karşılaştırıldığında daha net ve belirgin olduğu bulunmuştur.
Dokulara hızlı nüfuz etme özelliklerinden dolayı en çok tercih edilen solüsyonlar, mDF ve Bouin fiksatifleridir. Bu durum yapılarında bulunan asetik asitten kaynaklanmış olabilir. Çünkü asetik asitin önemli bir özelliği de hızlı penetrasyon yeteneğine sahip olmasıdır. Bu durum daha sonraki kesit alma aşamasında kolaylık sağlamıştır (Latendresse ve ark., 2002).
55
Epididimis dokusu üzerine fiksatifler ile alakalı olarak yapılan çalışmaların yetersiz oluşu, bizi literatür taramalarında yapısal benzerlik nedeniyle testis dokusu ile ilgili çalışmaları baz almamızı zorunlu kılmıştır. Yapılan çalışmaların sonucu ile kendi bulduğumuz sonuçların arasında benzerlik olması çalışmamızın güvenirliğini artırmıştır.
Bu bağlamda epididimis üzerine yapılan çalışmamızın erkek üreme sisteminde meydana gelebilecek çeşitli hastalıkların teşhis edilmesini, tanı koyulmasını ve laboratuvarlardaki deneysel süreçleri de kısaltacağı düşüncesindeyiz.
56
6. SONUÇ VE ÖNERİLER
Dokuların mikroskobik inceleme sürecindeki en önemli basamağı tespit aşamasıdır. Dokularda büzüşme ve artefaktların oluşumunun engellenmesi için dikkat edilecek basamaklardan biri de dokulara uygun tespit solüsyonunun seçimidir.
Çalışmamızda kullanılan mDF ve BF gibi iki farklı tespit solüsyonunun dokunun morfolojik yapısını bozmaması, boyanmasına engel oluşturmaması ve stereolojik çalışmalarda kolaylık sağlaması gibi özelliklerine bakılarak karşılaştırılması yapılmıştır. Fakat kullanılan bu iki tespit solüsyonunun birbiri üzerine herhangi bir üstünlük kuramadığı gözlenmiştir (p˃0.005). Hücrelerin morfolojik olarak iyi korunması ve büzüşmelerin gerçekleşmemesi dikkat çekmiştir.
Özellikle BF’nin içeriğinde pikrik asit bulunması nedeniyle dokulardan arındırılması noktasında sıkıntılar yaşanmıştır. Dokudan arındırılması deneysel süreci uzatmış ve dokunun çok fazla alkol serilerinden geçirilmesine neden olmuştur. Bu durum daha sonra da dokunun genel anlamda boyanma kalitesini düşürmüştür.
Epididimis gibi hassas dokular tespit edilirken solüsyonların içeriği daha az toksik ve dokulara hızlı nüfuz etme özelliğinde olmasına dikkat edilmelidir. Kullanılan tespit solüsyonları hücrelerin hem morfolojik hemde histolojik düzeyde incelenmesi sürecinde sonucun doğruluğunu etkileyecek en önemli etkenlerden biridir.
Ülkemizde yapılmış olan birçok histolojik ve morfolojik çalışmalar dikkate alındığında, diğer solüsyonlara oranla önerilen tespit solüsyonlarının içerisinde mDF ve BF’nin daha çok kullanıldığı gözlenmektedir.
Deneysel çalışmalarda tespit aşaması, dokular üzerinde yapılan histolojik ve morfolojik çalışmalarda doğru analizlerde bulunabilmede önemli bir unsurdur.
Çalışmamızda özellikle epididimis gibi hassas ve mekanik hasardan etkilenebilecek dokular için en ideal tespit solüsyonunun mDF ve BF olduğu ortaya çıkmıştır.
57
KAYNAKLAR
Abe K, Takano H, Ito T. Microvasculature of the mouse epididymis, with special reference to fenestrated capillaries localized in the initial segment. Anat Rec.
1984, 24: 209-218.
Abou-Haila A, Fain-Maurel MA. Regional differences of the proximal part of mouse epididymis: morphological and histochemical characterization. Anat. Rec. 1984, 209:197–208.
Adamali HI, Hermo L. Apical and narrow cells are distinct cell types differing in their structure, distri- bution, and functions in the adult rat epididymis. J. Androl. 1996, 17: 208–222.
Adamali HI, Somani IH, Huang JQ, Mahuran D, Gravel RA, Trasler JM, Hermo L. Abnormalities in cells of the testis, efferent ducts, and epididymis in juvenile and adult mice with beta-hexosaminidase A and B deficiency. J. Androl. 1999, 20:779–802.
Altunkaynak ME, Ozbek E, Altunkaynak BZ, Can I, Unal D, Unal B. The effects of high-fat diet on the reanl structure and morphometric parametric of kidneys in rats. J
Anat 2008, 212 :845-832.
Amann RP. A critical review of methods for evaluation of spermatogenesis from seminal characteristics. J. Androl. 1981, 2:37–58.
Arends MJ, Morris RG, Wyllie AH. Apoptosis: the role of the endonuclease. Am. J. Pathol. 1990, 136:593–608.
Arnold MM, Srivastava S, Fredenburgh J. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic and Histochemistry 1999, 71:224–230.
58
Baker JR. Principles of biological microtechnique: a study of fixation and dyeing. London, 1958, 2:19-139.
Bancroft JD. Theory and practice of histological techniques. Edınburg London Melbourne and New York 1990, 31:53-74.
Bauer H. Microskopisch-chemischer Natwer’s von Glykogen und einigen anderen Polysaccharden. Zeitschrift für mikroskopischeanatomische Forschung 1933, 10: 33- 143.
Benoit J. Recherches anatomiques, cytologiques et histo- physiologiques sur les voies excrétrices du testicule chez les mammifères. Arch. Anat. Histol. Embryol. (Strasb). 1926, 5: 173–412.
Boivin J, Bunting L, Collins JA, Nygren KG. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Hum Reprod 2007, 22:1506–1512.
Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. ASCP Press. Chicago,1997.
Cohen DJ, Maldera JA, Vasen G, Ernesto JI, Muñoz MW, Battistone MA & Cuasnicú PS. Epididymal protein CRISP1 plays different roles during the fertilization process. Journal of Andrology 2011, 121: 197-281
Cooper TG. The Epididymis, Sperm Maturation and Fertilisation. Springer-Verlag, New York,1986.
Cooper TG. In defense of a function for the human epididymis. Fertil Steril. 1990, 54:965–975.
59
Cooper TG, Yeung CH, Wagenfeld A, Nieschlag E, Poutanen M, Huhtaniemi I, Sipila P. Mouse models of infertility due to swollen spermatozoa. Mol Cell Endocrinol 2004, 216: 55-63.
Cooper TG. Sperm maturation in the epididymis: a new look at an old problem. Asian J Androl. 2007, 9:533–539.
Creasy DM, Jonassen H. Histological fixation of testes: Use of Davidson’s fluid as an Bouin’s fluid. Vet pathol. 1999, 36: 518.
Crookham J, Dapson R. Hazardous Chemicals in the Histopathology Laboratory. 2nd ed, 1991.
Dacheux JL and Dacheux F. Protein secretion in the epididymis. In The Epididymis: From Molecules to Clinical 2002:151-168.
Dapson RW. Fixation for the 1990s: a review of needs and accomplishments. Biotechnic and Histochemistry 1993, 68:75–82.
Depeiges A, Betail G, Coulet M and Dufaure JP. Histochemical study of epididymal secretions in the lizard, Lacerta vivipara. Cell. Tissue Res. 1985, 57: 463–466.
Diamanti-Kandarakis E, Bourguignon JP, Giudice LC, Hauser R, Prins GS, Soto AM, Zoeller RT, and Gore AC. Endocrinedisrupting chemicals: An Endocrine Society scientific statement. Endocr Rev 2009, 30:293–342.
Ellerman DA, Brantúa S, Martínez SP, Cohen DJ, Conesa D, Cuasnicú PS. Potential contraceptive use of epididymal proteins: immunization of male rats with epididymal protein DE inhibits sperm fusion ability. Biology of Reproduction, 1998, 216:1029- 1036.
Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle W. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. Journal of Histotechnology 2001, 24:173–190.
60
Eltoum IE, Fredenburgh J, Grizzle WE. Advanced concepts in fixation: effects of fixation on immunohistochemistry and histochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues, special methods of fixation. Journal of Histotechnology 2001, 24: 201–210.
Flesch FM, Gadella BM. Dynamics of the mammalian sperm plasm membrane in the process of fertilization. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 219:197-235.
Flickinger CJ, Bush LA, Howards SS, Herr JC. Distribution of leucocytes in the epithelium and interstitium of four regions of the Lewis rat epididymis. Anat. Rec. 1997, 248:380–390.
Flickinger CJ, Herr JC, Klotz KL. Immunocytochemical localization of the major glycoprotein of epididymal fluid from the cauda in the epithelium of the mouse epididymis. Cell. Tissue Res. 1988, 251:603–610.
Fouchecourt S, Matayer S, Locatelli A, Dacheux F, Dacheux JL. Stallion epididymal fluid proteome: qualitative and quantitative characterization; secretion and dynamic changes of major proteins. Biology of Reproduction. 2000, 128:1790-1803.
Fox CH, Johnson FB, Whiting J, Roller PP. Formaldehyde Fixation. J Histochem Cytochem. 1985,33:845–853.
França LR, Avelar GF, Almeida FFL. Spermatogenesis and sperm transit through the epididymis in mammals with emphasis on pigs. Theriogenology. 2005,110:300-318
Gatti JL, Castella S, Dacheux F, Ecroyd H, Métayer S, Thimon V, Dacheux JL. Post- testicular sperm environment and fertility. Animal Reproduction Science, 2004, 28:321-339.
Gartner LP, Hiatt JL. Color Textbook of Histology, 3rd ed. Philadelphia, Saunders Elsevier, 2007, 342:490-505.
61
Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 1992, 119:493– 501.
Gopalakrishna A, Bhatia D. Storage of spermatozoa in the epididymis of the bat, Hipposideros speoris (Schneider).1982, 49:951–953.
Grizzle WE, Stockard C, Billings P. The effects of tissue processing variables other than fixation on histochemical staining and immunohistochemical detection of antigens. Journal of Histotechnology 2001, 24:213–219.
Grizzle WE. Silver staining methods to identify cells of the dispersed neuroendocrine system. Journal of Histotechnology 1996, 11:225–234.
Grizzle WE, Myers RB, Manne U. The use of biomarker expression to characterize neoplastic processes. Biotechnic and Histochemistry 1997, 72:96–104.
Grizzle WE, Myers RB, Manne U. Factors affecting immunohistochemical evaluation of biomarker expression in neoplasia. In: Hanausek, M., Walaszek, Z. (Eds.), John Walker’s methods in molecular medicine–tumor marker protocols. 1998a: 161–179.
Grizzle WE, Myers RB, Manne U and Srivastava S. Immunohistochemical evaluation of biomarkers in prostatic and colorectal neoplasia. In: Hanausek, M., Walaszek, Z. (Eds.), John Walker’s methods in molecular medicine–tumor marker protocols. 1998b: 143–160.
Grizzle WE, Myers RB, Oelschlager DK. Prognostic biomarkers in breast cancer: factors affecting immunohistochemical evaluation. 1995, 30: 243–250.
Grizzle, WE, Fredenburgh J. Safety in biomedical and other laboratories. In: Patrinos G, Ansorg W. Molecular diagnostics. 2005, 33:421–428.
62
Groen F, Young IT, Lignart GA. Comparison of different focus functions for use in autofocus algorithms. Cytometr,1985, 6:81-91.
Hamilton DW. The mammalian epididymis. In Reproductive Biology (H. Balin and S. Glassner, Eds.). 1972, 14:268–337
Hamilton DW. Structure and function of the epithelium lining the ductuli efferentes, ductus epididymidis and ductus deferens in the rat. In Handbook of Physiology. 1975, 215:259–301.
Harley RA. Histochemical and immunochemical methods of use in pulmonary pathology. In: Spicer, S.S. (Ed.), Histochemistry in pathologic diagnosis. Marcel Dekker, New York,1987.
Hayat MA. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications, 4th ed. Cambridge University Press, New York, 2000.
Hewitt SM, Lewis FA, Yanxiang C, Conrad RC, Cronin M, Dnaneberg KD. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology. Arch Pathol Lab Med. 2008, 132:1929–1935.
Hemeida NA, Sack W, McEntee K. Ductuli efferentes in the epididymis of boar, goat, ram, bull, and stallion. Am. J. Vet. 1 9 7 8 , 1 2 : 1892–1900.
Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000, 407:770–776.
Hennigar GR. Techniques in nephropathology. In: Spicer, S.S. (Ed.), Histochemistry in pathologic diagnosis. Marcel Dekker, New York,1987.
Hermo L, Adamali HI, Andonian S. Immunolocalization of CA II and H V-ATPase in epithelial cells of the mouse and rat epididymis. J. Androl. 2000, 21:376–391.
63
Hermo L and Robaire B. Epididymis cell types and their function. In The Epididymis: From Molecules to Clinical Practice (B. Robaire and B. T. Hinton, Eds.), 2000, 61: 81–102.
Hermo L, Dworkin J and Oko R. Role of epithe- lial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. Am. J. Anat. 1988, 183:107–124.
Hermo L, Oko R, Morales CR. Secretion and endocytosis in the male reproductive tract: a role in sperm maturation. Int. Rev. Cytol. 1994, 154:106–189.
Hermo L, Oko R, Robaire B. Epithelial cells of theepididymis show regional variations with respect to the secretion or endocytosis of immobilin as revealed by light and electron microscope immunocytochemistry. Anat. Rec.1992, 232: 202–220.
Hess RA, Fernandes SAF, Gomes GRO, Oliveira CA, Lazari MFM. Estrogen and its Receptors in Efferent Ductules and Epididymis. Jounal of Andrology, 2011, 32:193- 464
Hess RA, Zhou Q, Nie R, Oliveira C, Cho H, Nakai M, Carnes K. Estrogens and epididymal function. Reproduction, Fertility and Development, Vol. 2001, 13: 273- 283
Huang BQ, Strout GW, Russell SD. Fertilization in Nicotiana tabacum: ultrastructural organization of propane-jet-frozen embryo sacs in vivo. 1993, 191:256–264
Huang BQ, Yeung EC. Chemical and physical fixation of cells and tissues: an overview. Springer International Publishing Switzerland. 2015, 67: 23-32.
Johnson AL, Howards SS. Intratubular hydrostatic pressure in testis and epididymis before and after vasectomy. Am. J. Physiol. 1975, 228:556–564.
64
Kelder W, Inberg B, Plukker JTM, Groen H, Baas PC, Tiebosch ATMG. Effect of modified Davidson's fixative on examined number of lymph nodes and TNM-stage in colon carcinoma. European Journal of Surgical Oncology 2008, 34(5): 525-530
Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972, 26:239–57.
Kerr JF. History of the events leading to the formulation of the apoptosis concept. Toxicology 2002;181– 182:471–4.
Kirchhoff C. Gene expression in the epididymis. Int. Rev. Cytol. 1999, 188:133–202.
Kirchhoff C. Specific gene expression in the human and non-human primate epididymis. In The Epididymis: From Molecules to Clinical Practicepp. 2002, 112: 201–218.
Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: Comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicologic Pathology , 2002, 30(4): 524-533.
Lihui TU, Lili YU , Huiping ZHANG. Morphology of Rat Testis Preserved in Three Different Fixatives. Center of Reproductive Medicine , 2011,31(2):178-180
Lillie RD, Fullmer HM. Histopathologic technic and practical histochemistry, 4th ed. McGraw-Hill, New York, 1976.
Lillie RD. Reticulum staining with Schiff reagent after oxidation by acidified sodium periodate. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 1947,32: 910–912.
Lillie RD. Histochemical comparison of the Casella, Bauer and periodic acid oxidation leucofuchsin techniques. Stain Technology 1951, 26: 123–136.
Login GR, Dvorak AM. Methods of microwave fixation for microscopy—a review of research and clinical applications: 1994,27:1–119.
65
Macaluso M, Wright-Schnapp TJ, Chandra A, Johnson R, Satterwhite CL, Pulver A, Berman SM, Wang RY, Farr SL, Pollack LA. A public health focus on infertility prevention, detection, and management. Fertil Steril, 2010, 93:11-10.
Martini FH, Timmons MJ and Tallitsch RB. Human Anatomy. (7th Edition). San Francisco, 2002.
Mascarenhas MN, Flaxman SR, Boerma T, Vanderpoel S, Stevens GA. National,