Biyopsi Örneklerinin Al nmas

Çal maya kat lan hastalara, en az sekiz saatlik açl ktan sonra Fujinon SN 2 GN20 A003 veya SN 1 GN20 A923 marka videoendoskopla üst gastrointestinal sistem (GIS) endoskopisi yap ld . Endoskopi öncesi, endoskopi s ras nda ve sonras nda hastalara bizzat refakat edildi. Endoskopi öncesinde %10'luk Xylocain pump sprey ile farinkse lokal anestezi uyguland . Retrospektif hasta grubundan endoskopi s ras nda mide antrum ve korpusundan dörder olmak üzere toplam sekiz, prospektif hasta grubundan ise üçer olmak üzere toplam alt biyopsi örne i al nd . Bir korpus ve bir antrum biyopsi örne ine endoskopi s ras nda HUT uyguland . Retrospektif tüm hasta grubunda bir korpus ve bir antrum örne i, prospektif hasta grubunda ise Uzman Endoskopist taraf ndan gerekli görüldü ü takdirde bir korpus ve/veya bir antrum örne i histopatolojik aç dan incelenmek üzere Patoloji Anabilim Dal ’na gönderildi. Di er bir korpus ve bir antrum örne ine ise kültür ve biyopsi PCR yöntemi uygulanmas için T bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal ’na ula t r ld .

5.2.1. H zl Üreaz Testi (HUT)

Bir gram üre 10 ml steril distile suda eritilerek haz rlanan kar mdan her test tüpüne birer ml da t ld (pH <8.1). Korpus ve antrum örnekleri üre solüsyonu içeren birer test tüpüne konuldu ve üzerlerine iki er damla % 0.1’lik fenol k rm z s solüsyonu eklenerek 0-10- 15 dakika, 3-5 saat ve 24 saat içerisinde HUT sonucu de erlendirildi. Üreli solüsyon içerisindeki gastrik biyopsi örne i H. pylori ile enfekte ise bakterinin üreaz enzimi varl nda üre hidrolizi sonucunda aç a ç kan 2 NH3 ve 2 CO2 ile pH’s n n de i mesi ile renk ve pH

indikatörü fenol k rm z s üreli solüsyonda pembe renk de i iminin görülmesi (pH >8.1) pozitif, rengin de i memesi ise negatif olarak de erlendirildi.

i. Endoskoplar n Sterilizasyonu:

Endoskoplar n önce mekanik olarak temizli i su ile y kan p f rçalanarak, daha sonra %2’lik glutaraldehit içeren Fujinon Choyang otomatik y kama makinesi ile 20 dakika y kanmas endoskopi ünitesinde yap lmakta ve su ile durulan p kurutularak bir sonraki hasta için uzman endoskopist taraf ndan kullan lmak üzere haz rlanmaktad r.

5.2.2. Biyopsi Örneklerinin Histopatolojik ncelenmesi:

Retrospektif tüm hasta grubunda bir korpus ve bir antrum örne i, prospektif hasta grubunda ise Uzman Endoskopist taraf ndan gerekli görüldü ü takdirde bir korpus ve/veya bir antrum örne i histopatolojik aç dan incelenmek üzere hemen %10’luk formalin solüsyonu içeren i elere al nd . Ayr ayr i elerde al nan bölgeler belirtilerek rutin histopatolojik inceleme istemi ile Patoloji Anabilim Dal 'na ula t r ld .

118 hastada; 92 retrospektif hastan n 91’inin antrum ve korpus toplam 182, 1’inin yaln zca antrum biyopsi örne i; 32 prospektif hastan n 17’sinin antrum ve korpus toplam 34, 9’unun yaln zca korpus biyopsi örne i olmak üzere toplam 226 biyopsi örne i gastrointestinal patoloji ile ilgili patoloji uzman taraf ndan H&E, Alcian blue ve Giemsa boyalar ile boyanarak k mikroskobunda (Nikon E600) morfolojik olarak incelendi. Lamina propria’da, pitlerde enflamasyon, atrofi, intestinal metaplazi (IM) ve HPL her biri 0-3 aras olarak güncelle tirilmi Sydney Sistemine göre de erlendirildi (124).

5.2.3. Hastalar n Helicobacter pylori Enfeksiyonu Yönünden De erlendirilmesi

Al nan her bir korpus ve antrum biyopsi örneklerine uygulanan histopatolojik inceleme, HUT ve kültürün, en az ikisinin pozitif oldu u olgular H. pylori enfeksiyonu olumlu; tümünün olumsuz oldu u olgular H. pylori enfeksiyonu olumsuz kabul edildi. Ancak yaln zca HUT veya histopatolojik incelemeden birinin olumlu oldu u hastalar etik ve klinik yönden

H. pylori enfeksiyonu olumlu olarak de erlendirildi inden, çal mam zda da H. pylori

5.2.4. Biyopsi Örneklerinin Mikrobiyolojik ncelenmesi

5.2.4.1. Helicobacter pylori Kültür Protokolü

i. Besiyerlerinin Haz rlanmas

%7 At Kanl Helicobacter pylori Seçici Besiyeri:

§ Columbia Blood Agar 19.5 gr/ml

§ Defibrine At Kan 35 ml.

§ H. pylori Selective Supplement (DENT) 1 vial 500 ml besiyeri için

§ Distile su 465 ml.

Columbia Blood Agar (Oxoid) besiyerinden 19.5 gr 465 ml distile su içerisine ilave edildi ve 121 °C’de 15 dakika otoklavland . Besiyeri 50°C’ye geldi inde 35 ml steril defibrine at kan (Horse Blood Defibrinated, Oxoid) ve 2 ml steril distile su içerisinde eritilen H. pylori Selective Supplement (DENT, Oxoid) besiyerine ilave edildi. Daha sonra besiyeri 90 mm petrilere aseptik ko ullarda döküldü. Besiyerleri donduktan sonra kontaminasyon kontrolü için besiyerleri 24 saat etüvde bekletildi. Besiyerleri po etlenerek buzdolab nda +4°C’de sakland .

Transport besiyerinin haz rlanmas :

Brucella Broth (Beckton Dickinson and Company) besiyerinden 2.8 gr 80 ml distile su içerisine eklendi ve 121 °C’de 15 dakika otoklavland . Otoklavdan sonra gliserol solüsyonundan (Baked Analyzed) 20 ml eklendi. Steril ependorflara 1’er ml olacak ekilde alikotland ve buzdolab nda +4°C’de sakland .

%20 Gliserollü Stok besiyerinin haz rlanmas :

Gliserol solüsyonu (%40) ve 40 ml Brain Heart Infusion (BHI) Buyyon (Beckton Dickinson and Company) 121°C’de 15 dakika ayr ayr otoklavland . Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuvarlar Seroloji Laboratuvar ’ndan serolojik olarak taranm taze insan serumu filtre edilip 56°C’de 30 dakika su banyosunda inaktive edildi. Bu

besiyeri için haz rlananlar ve 10 ml steril taze insan serumu kar t r larak steril ependorflara 1’er ml olacak ekilde alikotland . Buzdolab nda +4°C’de sakland .

ii. Kültür Protokolünün Uygulanmas

§ Endoskopi s ras nda al nan bir antrum ve bir korpus gastrik biyopsi örnekleri % 20 Gliserollü Brucella broth içeren H. pylori transport besiyeri ile T bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal ’nda laboratuvara getirildi. Transport besiyeri içerisindeki gastrik biyopsi örnekleri aseptik ko ullarda steril petrilerin içerisine al nd ve biyopsi örnekleri steril bistüri veya doku homojenizatörü (Sigma Aldrich) ile ezilip parçaland .

§ Parçalanan biyopsi örneklerinin pasaj % 7 at kanl Columbia Blood agar besiyerine yap ld . Ekim yap lan plaklar 37°C’de 3-7 gün anaerobik jar (Oxoid) içerisinde GasPak Campy Container System (Becton Dickinson and Company) kullan larak olu turulan mikroaerofilik ko ullarda enkübe edildi.

§ Kültür öncesi parçalanan antrum ve korpus biyopsi örneklerinin her birinden bir k s m kültürle e zamanl olarak antrum ve korpus için ayr ayr Christensen’s üreli agar besiyerine direkt biyopsiden üreaz testi için konuldu. Ayn zamanda direkt dokudan imprint preparat haz rland ve modifiye Gram boyamas ile boyand . Doku hücrelerinin aras nda H. pylori varl ve tipik morfoloji k mikroskobunda (Olympus, CX31 RTSF) 100X immersiyon objektifi ile incelendi.

§ Üreyen kolonilerin %7 at kanl Columbia Blood agar besiyerine pasajlanarak subkültürleri yap ld . Ayr ca enkübasyon sonras üreyen H. pylori kolonilerinin direkt bak s , katalaz, oksidaz, üreaz testleri ve modifiye Gram boyamas yap ld . Gram (-) H.

pylori varl ve tipik morfolojisi k mikroskobunda (Olympus, CX31 RTSF) 100X immersiyon objektifi ile incelendi.

§ Subkültürden üreyen H. pylori kolonileri %20 gliserollü BHI buyyon içeren stok besiyeri ile homojenize edilerek -80 °C’de sakland .

*** Retrospektif olarak çal maya al nan 65 dispeptik yak nmal hastan n korpus ve antrum biyopsi örnekleri New York Üniversitesi Veterains Affair Laboratuvar nda uygulanan kültür protokolüne göre Prof. Dr. Özlem Y lmaz’ n di er bir projesi kapsam nda Prof. Dr. Guillermo I. Perez-Perez ve grubu taraf ndan daha önceden çal lm t r.