3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.6. Biyolojik Etki Araştırmaları
Antiinflamatuvar aktivite çalışmaları Koç Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji Bölümü öğretim üyesi Prof. Dr. Hakan Sedat Örer tarafından yapılmıştır.
3.6.1.1. Hücre Kültürü Testleri
Bileşiklerin in vitro aktiviteleri ikili bir hücre kültürü serisi (HEK BLUETM
IL-1β hücreleri ve HEK BLUETM
hTLR2 hücreleri) kurularak, salgılanan alkalen fosfataz miktarının ölçümü yoluyla test edilmiştir.Bu yöntem, Toll benzeri reseptör 2 (TRL2)’ yi eksprese eden HEK BLUE hücrelerinin lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılmasını takiben interlökin-1 (IL-1salgılaması ve salgılanan IL-1’nin IL-1R eksprese eden diğer bir HEK BLUE hücre dizisini uyararak alkalen fosfataz salgılatması esasına dayanmaktadır. Salgılanan alkalen fosfataz miktarın SEAP (salgılanmış embriyonik alkalen fosfataz) deneyi ile ölçülmektedir. Aktivite dışında bileşiklerin seçicilikleri de test edilmiştir. Bileşiklerin IL-1R’ yi inhibe ederken TLR2’ yi inhibe etmemesi istenmektedir. Bu deneylerde, bileşiklerin varlığında, IL-1R eksprese eden hücre dizileri, IL-1 ile, TLR2 eksprese eden hücre hatları ise LPS ile uyarılarak salgılanan alkalen fosfataz miktarları ölçülmüş, IL-1 ve LPS ile elde edilen IC50 değerleri karşılaştırılarak, bileşiğin IL-1R reseptörlerini hangi düzeyde seçici biçimde bloke ettiği değerlendirilmiştir (Gatfar 2015 pp. 18-47).
3.6.1.2. Hücre Canlılık Testi
Hücre canlılığının değerlendirilmesi 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H-tetrazolyum (MTS) metodu ile yapılmıştır. Bileşiklerin stok solüsyonları 10 mM olacak şekilde DMSO içinde çözülerek hazırlanmıştır. 96 kuyucuklu hücre plakları kullanılmıştır. Her bileşik, 20 µM’ dan başlayarak 12 farklı konsantrasyonda seri seyreltme ile hazırlanıp test edilmiştir. Seyreltmeler için, önceden ısıtılmış DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) kültür ortamı (% 10 fetal sığır serumu + % 1 penisilin/ streptomisin) kullanılmıştır. HEK BLUE hücre dizilerinin hazırlanması için % 1 DMSO’ lu DMEM hazırlanıp kuyucuklara ilave edilmiştir. Her kuyucukta 3x104
hücre olacak şekilde hücre süspansiyonu hazırlanmış, üzerine agonist (HEK BLUETM
IL-1β hücreleri için hIL-1β proteini ve HEK BLUETM TLR2 hücreleri için LPS) eklendikten sonra her kuyucuğa 150 µl eklenmiş ve 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonra deney plakları, SEAP’ te kullanılmak üzere 40 µl’si transfer edildikten sonra, MTS deneyi için kullanılmıştır. Her bir kuyuya 15 µl MTS reaktifi eklenmiş, ardından deney plakları 3 saat boyunca inkübasyona bırakılmış ve 3 saatlik inkübasyon sonrasında her bir kuyudaki absorbans 490 nm’ de ölçülmüştür (Gatfar 2015 pp. 18-47).
3.6.1.3. SEAP Deneyi
SEAP deneyinin amacı salgılanan alkalen fosfataz miktarının ölçülmesidir. Deneyde kullanılan, genetik yapısı değiştirilmiş hücre hatları; IL-1R ve TLR2 reseptörlerinin aktivitesine bağlı olarak SEAP geninin transkript edilmesini sağladığı için SEAP deneyi, ilaçların inhibisyon miktarını ölçmek amacıyla kullanılmaktadır. Bu deney için önceden kolorimetrik solüsyon olarak 1 litre (l) 2 M dietanolamin çözeltisi hazırlanmış, üzerine, 1 mM MgCl2 ve 0,5 mM ZnCl2 eklenmiş, daha sonra bu çözeltinin 20 ml’ sine 20 mg p-nitrofenil fosfat ilave edilmiştir. Diğer yandan % 15’ lik CHAPS (deterjan) hazırlanıp, son konsantrasyonu % 0,05 olacak şekilde DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) kültür ortamı ile karıştırılmıştır. 96 kuyucuklu plağa 20 µl CHAPS eklenmiştir. Üzerine 24 saat önceden hazırlanmış hücre süspansiyonundan 40 µl, kolorimetrik solüsyondan 200 µl ilave edilmiş ve 1 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında her bir kuyudaki absorbans 405 nm’ de ölçülmüş ve konsantrasyon yanıt eğrileri çizilmiştir (Gatfar 2015 pp. 18-47).
3.6.2. Antikanser Aktivite Tayini
Antikanser aktivite çalışmaları Anadolu Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Miriş Dikmen tarafından yapılmıştır.
3.6.2.1. Hücre Kültürü ve Tedavileri
Bileşiklerin sitotoksik etkilerini incelemek amacıyla bu çalışmada, U87-MG insan glioblastoma (ATCC® HTB-14™) ve A549 insan akciğer adenokarsinoma (ATCC® CCL-185™) hücre grupları, kontrol grubu için CCD-19LU insan normal akciğer fibroblast (ATCC® CCL-210™) hücre grubu kullanılmıştır. Hücre grupları 37 °C’ de % 5 CO2 ile nemlendirilmiş, 2 mM L-glutamin, % 10 fetal sığır serumu ve % 1 penisilin/ streptomisin ilave edilerek zenginleştirilmiş EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium) kültür ortamı kullanılarak inkübe edilmiştir. Pozitif kontrol olarak sisplatin kullanılmıştır. Bileşikler ve pozitif kontrol grupları DMSO içinde çözülmüştür. Kontrol olarak % 0,1 DMSO kullanılmıştır (Mosmann 1983; Dikmen ve ark. 2011). 3.6.2.2. [3-(4,5-Dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] (MTT) Hücre
Canlılık Testi
Hücre grupları, her plakadaki hücre sayısı 5x103
olacak şekilde 96' lık mikroplakalara ekilmiştir. Ekilen hücreler önce kültür ortamı içinde 24 saat farklı konsantrasyonlardaki (400, 200, 100 ve 50 µM) bileşikler ile inkübe edilmiş, daha sonra 0,5 mg/ ml MTT çözeltisi ilave edilerek 4 saat daha inkübe edilmiştir. İnkübasyon işleminden sonra kültür ortamı plakalardan uzaklaştırılarak yerine 100 µl DMSO ilave edilmiş ve 540 nm de absorbans değerleri ölçülmüştür (Mosmann 1983; Dikmen ve ark. 2011).
3.6.3. Antiviral Aktivite Tayini
Sentezlenen bileşiklerin (6a, 6d, 6j, 6l, 7a ve 7j hariç) antiviral aktiviteleri ve sitotoksisiteleri Leuven Katolik Üniversitesi Rega Tıbbi Araştırmalar Enstitüsü Viroloji ve Kemoterapi Laboratuvarı’ nda Prof. Dr. Lieve Naeasens tarafından HSV-1, HSV-2, HSV-1 TK- KOS ACVr, VV, adenovirüs-2, insan koronavirüsü, influenza A (H1N1, H3N2), influenza B, VSV, coxsackie virüs B4, respiratuvar sinsitiyal virüs, parainfluenza-3 virüsü, reovirüs-1, sindbis virüsü, punta toro virüsü ve sarı humma virüslerine karşı test edilmiştir. Ayrıca 6g, 6n, 7g, 7k, 7m ve 7n bileşikleri HIV-1 (strain IIIB) ve HIV-2 (strain ROD) virüslerine karşı test edilmiştir.
3.6.4. Antitüberküloz Aktivite Tayini
Antitüberküloz aktivite çalışmaları Anadolu Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Dr. Öğr. Üyesi Zerrin Cantürk tarafından yapılmıştır.
3.6.4.1. Hücre Kültürü Testleri
MTB H37Rv (ATCC 27294), mikobakteriyel büyüme indikatör tüpü (BD BACTEC™ MGIT™) içerisinde yedi günde canlandırılmıştır. Daha sonra antitüberküloz aktivite tayini için Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri hazırlanmış, besiyerini zenginleştirmek için ADC (albümin-dekstroz-katalaz) ve oleik asit ilave edilmiştir. Geliştirilen mikroorganizmalar Mc Farland Standart No:1’ e göre ayarlanarak deneyler için hazır hale getirilmiştir (Foongladda ve ark. 2002; Raut ve ark. 2008).
3.6.4.2. Hücre Canlılık Testi
Bileşikler 0,97-500 µg/ ml konsantrasyonda hazırlanmıştır. Pozitif kontrol olarak rifampisin kullanılmıştır. Bileşikler 96 kuyucuklu plakalarda MTB ile 7 gün 37 °C’ de inkübe edilmiştir. Üzerlerine 20 µl MTT canlılık boyası ilave edilip, 24 saat daha aynı koşullarda inkübe edilmiştir. İnkübasyon işleminden sonra 570 nm’ de absorbans değerleri ölçülmüş, canlılık durumları değerlendirilmiştir (Foongladda ve ark. 2002; Raut ve ark. 2008).