2.6.1. Plazma CK, CK-MB, LDH ve UA ölçümü
Plazma kreatin kinaz (CK), laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesi ve kreatin kinaz MB (CK-MB), ürik asit (UA) konsantrasyonu Siemens Dimension EXL marka otoanalizör cihazı ve aynı marka ticari kitler kullanılarak kolorimetrik yöntemle ölçüldü. CK ve LDH aktivitesi ve CK-MB konsantrasyonu U/L, UA seviyesi mg/dl olarak ifade edildi.
2.6.2. Doku Homojenatlarının Hazırlanması
-80 oC’de bekletilen dokuların homojenizasyondan bir gün önce sırasıyla -20
o
C ve +4 oC’de çözülmeleri sağlandı. Dokular hassas terazide tartılıp ağırlığının yaklaĢık 10 katı fosfat tamponu (50 mmol/L, pH 7,4) ile dilue edildi. Daha sonra homojenizatör (Wise Mix HG-15; Daihan Scientific, Seoul, Korea) ile soğuk zincirde mekanik olarak homojenize edildi. Elde edilen homojenatlar (%10) 4 oC’de 3200 rpm’de 30 dakika süreyle santrifüj edilerek supernatant I elde edildi. Supernatant I’den 1 ml miyeloperoksidaz (MPO), XO, MDA, antioksidan aktivite (AOA), SOD, CAT ve GPx ölçümü için ayrıldı. Kalan sıvıdan 1 ml alınarak üzerine 1 ml 3/5 oranında hazırlanan kloroform/etanol karıĢımı ile vortekslenip 30 dakika 3200 rpm +4 oC’de santrifüj edildi. Üstte oluĢan etanol fazından protein tayini yapıldı.
2.6.3. Miyeloperoksidaz (MPO) Aktivitesinin Ölçümü
MPO aktivitesinin ölçümü sıçanlar için üretilen USCN (Life Science Inc, Çin) marka test kiti kullanılarak ELĠSA yöntemiylegerçekleĢtirildi. Testin yapılıĢı kısaca Ģu Ģekildedir: Test kiti içeriğinde bulunan plate MPO için spesifik olan monoklonal antikor ile kaplıdır. Her plate çukurcuğuna standartlar veya örnekler uygun bir Ģekilde eklenir. Akabinde avidinle konjuge Horseradish peroksidaz (HRP)
32
eklenir ve inkübasyona bırakılır. Ardından TMB substrat solüsyonu eklenir. Enzim substrat reaksiyonu sülfirik asit solüsyonu eklenmesiyle durdurulur ve renk değiĢimi spektrofotometrik olarak 450 nm dalga boyunda ölçülür.
2.6.4. Ksantin Oksidaz (XO) Aktivitesinin Ölçümü
Ksantin oksidaz öncelikle hipoksantinin ksantine hidroksilasyonunu ve sonra ksantinin ürik asite oksidasyonunu katalize eder. NADH okside olurken XO güçlü bir reaktif oksijen türü olan süperoksit üretir. Ksantin oksidaz tespiti Cayman (ABD) marka test kiti (Cat no: 10010895) kullanılarak yapıldı. Testin temeli, hipoksantinin oksidasyonu sırasında XO’nun ilk olarak H2O2 üretmesini içeren bir dizi enzimatik
reaksiyona dayanır (ġekil 2.1.). Test kiti içeriğinde bulunan horseradish peroksidaz (HRP) varlığında hidrojen peroksit ile ADPH (10- asetil-3,7-dihydroxyphenoxazine) çokça reaktif bir bileĢik olan resorufin oluĢturmak için reaksiyona girer. Üretici kitapçığına uygun Ģekilde ölçülen değerler hesaplanarak XO aktivitesi bulundu ve U/mg protein olarak ifade edildi.
ġekil 2.1. Ksantin Oksidaz Test ġeması
2.6.5. Malondialdehit (MDA) Düzeyi Ölçümü
Cayman’ın (ABD) TBARS test kiti plazma, serum, idrar, doku homejenatları ve hücre lizatlarında lipit peroksidasyonunu test etmekte kullanılan basit, tekrarlanabilir ve standart bir araçtır. Yüksek sıcaklıkta (90-100 oC) ve asidik Ģartlar
33
kolorimetrik olarak 530 ya da 540 nm dalga boyunda, florometrik olarak ise 530 nm eksitasyon, 540 nm emisyon dalga boyunda ölçülür. Bu tez çalıĢmasında MDA seviyesi kolorimetrik olarak 530 dalga boyunda ölçüldü ve µM/g doku olarak ifade edildi.
ġekil 2.2. MDA-TBA BileĢimi
2.6.6. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesinin Ölçümü
Süperoksit dismutaz testi kiti (Cayman, 706002) XO ve hipoksantin tarafından üretilen süperoksit radikalinin tespiti için tetrazolium tuzunu kullanır (ġekil 2.3.). Süperoksit dismutazın bir ünitesi süperoksit radikalinin % 50’sinin dismutasyonunu göstermek için gerekli enzim miktarı olarak tanımlanır. Kullanılan süperoksit dismutaz testi tüm SOD tiplerinin (Cu/Zn, Mn ve FeSOD) ölçümüdür. Test plazma, serum, eritrosit lizatları, doku homojenatları ve hücre lizatlarında SOD aktivitesinin ölçümü için basit, tekrarlanabilir ve hızlı bir araçtır. Plazma ve doku homojenatlarında SOD aktivitesi üreticinin direktiflerine göre 450 nm dalga boyunda verdiği optik dansitenin okunmasıyla ölçüldü ve U/mg protein olarak ifade edildi.
34
2.6.7. Katalaz (CAT) Aktivitesinin Ölçümü
Katalaz (EC 1.11.1.6; 2H2O2 oksidoredüktaz) çoğu aerobik hücrelerde
bulunan bir antioksidan enzimdir. Katalaz hem normal aerobik metabolizma hem de patojenik ROS üretiminin toksik bir ürünü ve bir reaktif oksijen türü olan H2O2’nin
detoksifikasyonunda görev alır. Bu enzim H2O2’nin iki molekülünün moleküler
oksijene ve iki molekül suya dönüĢümünü katalize eder (Katalitik aktivite). Aynı zamanda düĢük molekül ağırlıklı alkollere elektron donörü olarak peroksidatik aktivite gösterir. Alifatik alkoller katalaz için spesifik bir substrat olarak sunulurken peroksidatik aktivite gösteren diğer enzimler bu substratları kullanmazlar.
Katalaz aktivitesi Cayman’ın test kiti kullanılarak belirlendi. Bu kit enzim aktivitesinin tespiti için katalazın peroksidatif fonksiyonunu kullanır. Bu yöntem H2O2’nin optimal konsantrasyonunda enzimin metanol ile reaksiyonuna dayanır.
CAT aktivitesi üreticinin direktiflerine göre 540 nm dalga boyunda verdiği optik dansitenin okunmasıyla ölçüldü ve nmol/dk/mg protein olarak ifade edildi.
2.6.8. Glutatyon Peroksidaz (GPx) Aktivitesinin Ölçümü
GPx aktivitesi Cayman marka analiz kiti kullanılarak gerçekleĢtirildi. GPx tayini GR ile bir çift reaksiyon sonrası indirekt olarak belirlenir. GPx tarafından hidroperoksitlerin indirgenmesi ile GSSG üretilir, ancak GR ve NADPH aracılığıyla GSGG’nin indirgenmiĢ durumu geri döndürülür.
GPx aktivitesi çalıĢma sonunda ELISA okuyucuda 340 nm dalga boyunda 5 kez ölçüldü ve nmol/dk/mg protein olarak ifade edildi.
35
2.6.9. Total Antioksidan Aktivite (AOA) Ölçümü
Toplam antioksidan aktivite ölçümü Cayman’ın test kiti ile yapıldı. Su ve yağda çözünen antioksidanlar bu protokolde ayrı ayrı değerlendirilmezler. Böylece vitamin, protein ve lipit yapıda, ayrıca GSH, ürik asit gibi yapıları içeren tüm antioksidanların kombine aktivitesi değerlendirilir. AOA mM/g doku olarak ifade edildi.
2.6.10. Protein Ölçümü
Dokularda protein ölçümü Lowry yöntemine göre gerçekleĢtirildi (Lowry ve ark 1951). Bu metod, peptit nitrojenlerin alkali ortamda bakır iyonları ile reaksiyonu ve akabinde aromatik aminoasitlerin bakırı katalizlediği oksidasyon aracılığı ile eklenen folin reaktifinin heteropolimolibden mavisine indirgenmesi prensibine dayanır. Sığır serum albumininden konsantrasyonları 2-50 mg aralığında standartlar hazırlanıp deney protokolüne uygulanmıĢtır. 700 nm dalga boyunda elde edilen optik dansitelerin konsantrasyona karĢı grafiği çizilerek elde edilen grafik eğimi protein hesaplamalarında kullanılmıĢtır. Protein seviyeleri mg/dl olarak ifade edildi.