Bitkilerde Stres Koşullarında Gen İfadesinin Düzenlenmesi

Yukarıda da bahsedildiği gibi, bitkiler zor çevresel koşullarda hayatta kalmak ve gelişimlerini sürdürmek için strese duyarlı genler tarafından düzenlenen fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler seviyede adaptasyonlar geliştirmişlerdir. Bitkilerin abiyotik strese adaptasyonunun ilk basamağı, çeşitli fizyolojik ve metabolik tepkilerin aktivasyonuna yol açan, stres sinyallerinin algılanmasını ve takibinde sinyal iletimini içerir. Strese tepki veren gen ifadesine stres sinyali algısının dönüşümünde yer alan sinyal iletim ağlarında, strese duyarlı promotörlerde bulunan çeşitli TF' ler ve cis- davranışlı elementler sadece gen ifadesi için moleküler anahtarlar olarak değil, aynı zamanda sinyalin terminal noktaları olarak işlev görür. Tek bir transkripsiyon faktörü, bir çok hedef proteinin ifadesini, TF' nin ilgili hedef genlerin promotörlerindeki cis- etkili elemente spesifik bağlanması yoluyla kontrol edebilir.

1.3.1.1. Gen İfadesinin Belirlenmesinde Kullanılan Analizler

Herhangi bir fonksiyonel genom araştırmasında ana adım, gen ifadesinin analizidir. Transkriptomiks, binlerce genin aynı anda ifadesini analiz eder; farklı koşullarda transkriptomda meydana gelen değişikliklerin büyük resmi oluşturmasıyla sonuçlanır. Gen ifadesi analizi çalışmaları iki kategoriye ayrılabilir: kapalı ve açık sistemler. Sadece iyi karakterize edilmiş genler, ilgilenilen genomun bilgisine bağlı olan kapalı sistemde analiz edilir. Belirli bir gen veya genom için herhangi bir bilgi mevcut değilse, kapalı sistemlerde değerlendirilemez. Kapalı sistemlerde kullanılan en yaygın yöntemler ‘kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PZR)’ ve mikro-dizi (mikro-array) sistemleridir. Kapalı sistemlerin aksine, açık sistemlerde transkriptoma ilişkin önceden kapsamlı bir bilgi gerekmemektedir, bu nedenle keşif alanı açıktır. Kapalı ve açık sistemler birbirini tamamlar. Bilinen genlerin yeni gen veya daha önce tanımlanmamış ortologları keşfedildiğinde, bunlar kapalı sistemlerde de kullanılabilir. Bu iki sistemin ortak özelliği, analiz sonuçlarının, hiyerarşilerin işlevsel rolü ile ek açıklama ve sınıflandırma için iyi planlanmış bir stratejiye ihtiyaç duyan gen listelerinde ortaya çıkmasıdır [53, 54]

23

1.3.1.1.1. Gerçek Zamanlı – PZR

Kantitatif gerçek zamanlı, floresan tabanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PZR) moleküler tıpta, biyoteknoloji, mikrobiyoloji ve diagnostikte kantitatif veri analizi için mRNA seviyesinin kesin olarak tespit edilmesini sağlayan bir teknolojidir. qRT-PZR analizinin içerdiği üç basamak aşağıdaki gibi sıralanabilir:

1. mRNA’ nın cDNA’ ya ters transkripsiyon reaksiyonu ile çevrilmesi.

2. cDNA amplifikasyonu.

3. Son ürünlerin gerçek zamanlı olarak tespit edilmesi ve miktarlarının belirlenmesi [54, 55]

Gerçek zamanlı-PZR, geleneksel PZR’ a kıyasla nükleik asitlerin miktarlarının belirlenmesi için oldukça güvenilir veriler üretir ve son derece geniş dinamik aralığa sahiptir. Polimeraz zincir reaksiyonu, bir DNA kalıbının kopyalarını üstel bir şekilde üretir. Kalıpta bulunan polimeraz reaksiyonunun inhibitörleri, reaktif sınırlaması veya pirofosfat moleküllerinin birikmesi nedeniyle, sonuçta PZR reaksiyonu artık bir üstel hızda ("plateau fazı" olarak bilinir) kalıp oluşturamaz hale gelir ve bazı reaksiyonlar diğerlerinden daha fazla ürün üretir. Bu durum PZR ürünlerinin son nokta miktar belirlemelerinin güvenilmez olmasının en önemli nedenidir. PZR ürünlerini çoğaltılırken veya "gerçek zamanlı" olarak ölçebilme imkânı ile PZR ürününün miktarının, reaksiyonun hala üstel aralıkta olduğu bir noktada ölçülmesi mümkündür. Sadece PZR reaksiyonunun bu üssel fazı sırasında, kalıbın başlangıç miktarını belirlemek için hesaplamak mümkün olur. Gerçek zamanlı PZR deneylerinde üssel faz sırasında, tüm numunelerin karşılaştırılabileceği bir floresan sinyal eşiği belirlenir. Bu eşik, arka plan floresan miktarının bir fonksiyonu olarak hesaplanır ve bir örnekten üretilen sinyalin arka plan floresanından önemli ölçüde daha büyük olduğu bir noktaya çizilir. Bu nedenle, bu eşiğe ulaşmak için yeterli floresan sinyali üretmek için gereken PZR döngüleri, ‘döngü eşiği’ veya ‘Ct’ olarak tanımlanır. Bu Ct değerleri, başlangıçtaki kalıp miktarı ile doğru orantılıdır ve mRNA ifade seviyelerini veya DNA kopya sayısını hesaplamak için temel oluşturur.

24

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, tek bir tüp içerisinde DNA amplifikasyonu ve saptama adımlarının bir arada gerçekleştirilebilmesini sağlayan floresan boyalar kullanır. SYBR Green I, günümüzde gerçek zamanlı-PZR analizlerinde en sık kullanılan çift iplikli DNA' ya özgü boyadır. Asimetrik bir siyanin boyası olan SYBR Green I, büyük ölçüde çift iplikli DNA' nın küçük boşluğuna diziden bağımsız olarak bağlanır. DNA’ ya bağlanmış olan boyanın ışıma şiddeti, serbest boyanınkinden 1000 kat daha fazladır ve bu nedenle, PZR sırasında ürün birikimini izlemek için çok uygundur. SYBR Green, 480 nm dalga boyunda mavi ışıkla uyarılabilir. Emisyon spektrumu, maksimum değere 520 nm' de ulaşır ve 0,8 'lik bir kuantum verimiyle ‘fluorescein‘ ile karşılaştırılabilir [56].

1.3.1.1.2. RNA Dizileme

Transkriptom terimi, ifade edilen tüm RNA transkriptlerinin tam seti; protein kodlaması (mRNA) yapan ve kodlama yapmayan (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, miRNA, lncRNA, piwi etkileşimli RNA ve benzeri) RNA türleri anlamına gelmektedir. Çeşitli çalışma yöntemleri ile genom geneli düzeyinde tüm işleyen transkriptlerin belirlenmesi, spesifik hücresel fonksiyonların moleküler mekanizmaları hakkında önemli miktarda bilgi sağlar. Günümüzde genom çapında bir ölçekte transkriptleri tanımlamak için iki deneysel teknik kullanılmaktadır; mikro-dizi teknolojileri ve yeni nesil RNA dizileme (RNA-Seq) teknolojileri. Çoğu durumda, iki metodu karşılaştırırken, RNA dizinleme teknolojilerinin, mikro-dizi teknolojilerine karşı; dinamik transkript aralığı, daha az arka plan gürültüsüne sahip olması, yeni transkript ve izoformları tespit edebilme yeteneği açılarından üstün olduğu bildirilmiştir [57].

RNA dizileme teknolojileri, bir örnekte mevcut olan tüm RNA' lann yüksek çözünürlükte araştırılması, dizilerinin belirlenmesi ve miktarlarının ölçülmesi işlemlerinin aynı zamanda gerçekleştirilebilmesini sağlar. Pratikte, "okuma" olarak adlandırılan milyonlarca kısa dizi, başlangıç RNA' larının rasgele pozisyonlarından sıralanır. Bu okumalar daha sonra, her bir genle hizalanmış okumaların sayısının, ifade seviyesinin bir ölçüsünü verdiği bir "transkripsiyonel haritayı" ortaya çıkarmak için bir referans genom üzerinde hesaplanabilir [58].

25

Daha kapsamlı bir yol olarak, RNA dizileme tabanlı transkriptom yaklaşımları çeşitli amaçlarla rutin olarak kullanılmaktadır, bu amaçlar şu şekilde sıralanabilir; (i) transkriptom profilini karakterize etmek, (ii) transkriptlerin ifade seviyesini ölçmek, (iii) ayrılan izoformları ve füzyon transkriptlerini tespit etmek, (iv) genomda yeni transkript bulmak, (v) küçük regülatör RNA'ları profillemek ve (vi) kodlayan varyantların tanımlanması. Protein kodlayan genlerin ifadelerinin gelişim, hastalık ya da diğer çevresel koşullara göre düzenlenmesi gerektiğinden tüm bu uygulamalar arasında gen ifade profillerinin aydınlatılması öne çıkmaktadır.